纖維素酶在中藥成分提取中的應用

 中藥材中植物藥占90%,植物藥的有效成分大多包裹在細胞壁中,對這些有效成分的提取,傳統的熱水、酸、堿、有機溶劑浸提法,受細胞壁主要成分纖維素的阻礙,往往提取效率較低"恰當地利用纖維素酶處理這些中藥材,可改變細胞壁的通透性,提高藥效成分的提取率。本文就纖維素酶的作用機理、影響酶促反應的因素及目前用于中藥有效成分的提取的研究情況作一綜述。
1 纖維素酶水解作用機理
     纖維素分子是由許多吡喃型的D-葡萄糖殘基通過β-1,4葡萄糖苷鍵連接而成的多糖鏈,天然纖維素為直鏈式結構,鏈與鏈之間有晶狀結構和排列次序較差的無定形結構;纖維素分子以結晶或非結晶方式組合成微原纖維,微原纖維集束形成微纖維,以微纖維為基本構造構成纖維素。纖維素的結晶度一般在30%~80%之間。
     纖維素酶由三類組成:(1)內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1-4,也稱EG酶或Cx酶);(2)外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC3-2-1-91),又稱纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)或C1酶;(3) β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC3-2-1-21),簡稱BG。
     纖維素酶解是一個復雜的過程,其最大特點是協同作用。內切葡聚糖酶首先作用于微纖維素的無定型區,隨機水解β-1,4-糖苷鍵,產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素,外切葡聚糖酶從這些非還原性末端上依次水解β-1,4糖苷鍵,生成纖維二糖及其它低分子纖維糊精,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成葡萄糖分子。這種協同作用普遍存在,除了上述協同作用,還可以發生在內切酶之間,外切酶之間,甚至發生在不同菌源的內切酶與外切酶之間。一般地說,協同作用與酶解底物的結晶度成正比。
     纖維素酶優先作用于纖維素的無定形區域,對結晶纖維素有一定的降解,但難度較大"值得慶幸的是,通過研究,我們對結晶纖維素降解的作用機制已有了一定的認識:在纖維素酶解的最初階段,EG和CBH能引起纖維素的分散化和脫纖化,使纖維素結晶結構被打亂導致變性,纖維素酶深入到纖維素分子界面之間,使其孔壁!腔壁和微裂隙壁的壓力增大,水分子介入其中,破壞纖維素分子之間的氫鍵,產生部分可溶性的微結晶。
     纖維素酶中單個組分的作用機制與溶菌酶相似,遵循雙置換機制。
2 影響纖維素水解的主要因素
2.1 酶復合物的組分及其比例 微生物產生的纖維素酶復合物不一定都有前述三類酶,而是因種類不同,差異較大。酶復合物的組分及其比例決定了它對纖維素的水解程度,組分較齊,比例適當的酶復合物對纖維素的水解能力較強。以研究得較多的菌種為例,絲狀真菌能產生大量的纖維素酶(20g/L),三類酶都有,而且比例適當,一般不聚集形成多酶復合體,能降解無定纖維素和結晶纖維素。陸地細菌產生纖維素酶的量較少(低于0.1g/L),主要是EG,因此大多數對結晶纖維素沒有活性。
     值得一提的是海洋細菌,目前僅有少數學者研究。王玢等從黃海深海海底篩選出一株產低溫纖維素酶的海洋適冷細菌(MB1),所產纖維素酶既能水解羧甲基纖維素,又能降解微晶纖維素,且有淀粉酶活。曾胤新等分離出產纖維素酶的極區低溫海洋細菌,同時產蛋白酶!淀粉酶和瓊脂酶。由于海洋細菌極具多樣性,對其廣泛深入研究,有希望獲得具有較高應用價值的產纖維素酶的菌株。
2.2 酶活 目前得到的菌株所產纖維素酶活性低,另一方面可能也因為纖維素降解難度大,纖維素酶解的轉換率數比淀粉低12量級,這使得在實際生產中應用成本太高。
     酶活較強的菌種有大霉、曲霉、根霉和青霉,特別是李氏木霉、綠色木霉、康氏木霉,是目前公認的較好的纖維素酶生產菌。陸地細菌中活力較強的菌種有纖維素菌屬、生孢纖維粘菌屬和纖維桿菌屬。
2.3 所用植物原料不同,酶解速度也不同 此中因素有三:（1）比表面積:比表面積是指單位質量顆粒狀物質的總表面積,纖維素的比表面積是纖維素的細度、細纖維化程度和長度變化的復函數,可間接反映纖維素酶抵達纖維素分子的難易程度。植物原料纖維素的比表面積越大,越有利于纖維素酶的作用。（2）木質素含量:纖維素酶在向纖維素內部擴散的過程中,受纖維素和木質素的可及性影響。擴散傳遞速度降低,致使酶解速度降低。木質素具有無效吸附作用,使纖維素酶用量增加。木質素還起屏蔽作用,其含量越高屏蔽作用就越大,從而降低了酶解率。木質素對酶解過程有無抑制作用,吸附后的纖維素酶是否仍有活性,尚無定論。（3）結晶度:植物原料的纖維素微細結構是由結晶區和非結晶區組成"在結晶區中,組成纖維的大分子呈有序排列狀態;在非結晶區中,大分子為無序排列狀態。結晶度是指纖維素中結晶部分占纖維整體的百分比例,主要反映結晶成分的平均值。一般地說,植物原料纖維素的結晶區難以被纖維素酶破壞、降解。
     Charpuray等以麥草為材料研究了幾種因素對酶解的影響,結果表明比表面積是主要因素,其次是木質素含量,最后是結晶度。
2.4 反應條件 不同來源的纖維素酶有不同的最佳反應條件。常見的纖維素酶產生菌中,如曲霉、青霉及木霉,產生的酶一般為酸性酶,酶的最適溫度大多在45~65℃之間,最適pH值大多在4.0~5.5之間。一些嗜堿和耐堿性的細菌,如Bacillus屬中的某些種,可以產生在堿性條件下保持較高活性的纖維素酶。至于海洋細菌,王玢等分離出的細菌產纖維素酶最適反應溫度為35℃,最適pH值為6.0,屬酸性酶。曾胤新等分離出的細菌所產纖維素酶的最適作用溫度皆為35℃。
此外,酶的用量、激活劑、抑制劑等都會影響纖維素水解及其速率。從目前的研究來看,纖維素酶的激活劑主要有:鈣離子和一些非離子表面活性劑纖維素酶的抑制劑主要有:離子表面活性劑,植物中丹寧類、酚類(各種白色素)成分。
3 纖維素酶在中藥成分提取中的應用現狀
     雖然目前纖維素酶用于植物藥效成分提取的研究尚不多見,但得出的結果比較一致,即酶解預處理能明顯提高植物藥有效成分的提取率。
     沈愛英等用由纖維素酶!果膠酶和蛋白酶按一定比例組成的復合酶,對姬松茸子實體酶解預處理后用熱水浸提,多糖提取率為15.7%;所需時間為單純熱水浸提的一半,而提取率明顯高于水浸提和酸、堿浸提。劉佳佳等在提取金銀花綠原酸時,增加了纖維素酶解工藝,結果能顯著提高金銀花提取物得率和綠原酸得率,最大可使綠原酸得率提高25.97%。趙寧等在提取干紅辣椒中辣椒素的研究中,得出結果:酶法提取工藝比傳統丙酮浸提法辣椒素產量提高了30%。馬田田用黃柏提取小檗堿,在纖維素酶的作用下,小檗堿的收率平均提高0.2856%,P值小于0.05,與未加酶法相比有顯著差異。楊軍宣等在三七的提取中用纖維素酶、三七總皂甙提取率提高23.5%。奚奇輝和王輝等分別用竹葉和銀杏葉提取黃酮,增加了纖維素酶處理步驟后,其含量比原方法分別提高23.5%和55.69%。
     纖維素大分子中的β-1,4-糖苷鍵是一種縮醛鍵,對酸特別敏感。因此目前常用的濃硫酸水解也能對纖維素造成一定的破壞。酶解與濃硫酸水解對藥效成分的提取率是否有明顯差異?對此,張彩霞等學者也做了一些工作。她們在用穿山龍提取薯蕷皂甙元的研究中,對比了酶法和酸法的提取效果,經過五次實驗,結果均為酶法的提取率明顯高于濃硫酸法。
     在提取成分分析方面,也有學者做一些工作。楊軍宣等分別用酶工藝和75%乙醇工藝提取三七總皂甙,其產物經薄層層析分析,兩種方法所提出的成分一致。馬田田用黃柏提取小檗堿也做了同樣的試驗,取對照品鹽酸小檗堿、加酶提取物和未加酶提取物做薄層層析,兩種提取方法所得成分一致,與對照品相同。張彩霞等在纖維素酶用于穿山龍中薯蕷皂甙元的提取實驗中,將薯蕷皂甙元對照品、加酶組與未加酶組工藝得到的提取物結晶,在同一硅膠G薄層板上展開,通過斑點的比較證明,兩種提取方法所得成分一致,與對照品相同,并且加酶組提取物有一定純度。由此表明,纖維素酶用于中藥有效成分的提取,對提取物成分影響小,而且純度也高。
4 應用纖維素酶于中藥成分提取中的優點
     纖維素酶解提取過程大致可分為兩個步驟:一是酶解破壁。用纖維素酶降解細胞表面結構及胞章連接物,部分胞內物質溶出;二是有效成分的提取。通過提高溫度等方法滅酶,用溶劑浸提有效成分。
     傳統的水、酸、堿、有機溶劑提取方法是利用濃度梯度使存在于植物藥纖維組織之內的有效成分逐步擴散到提取溶劑中,受植物細胞壁纖維組織的屏障作用,往往萃取時間長,需要使用大量溶劑,而且提取率較低,尤其是以富含纖維素的根、莖、皮類藥材為原料提取時,纖維素的屏障作用更為突出。植物細胞壁的主要成分是纖維素,恰當地利用纖維素酶處理,可使細胞壁發生不同程度的改變,如軟化、膨脹和崩潰等,從而可改變細胞壁的通透性,提高中藥成分的提取率,有利于壁內的藥效成分溶出,從而提高藥效成分的提取率。
     纖維素酶用于中藥有效成分的提取的優點有:(1)纖維素酶預處理能顯著提高藥效成分的提取率,而且操作簡便易行,對設備要求不高。(2)纖維素酶水解條件溫和,降低了隨后的溶劑提取的難度,使整個提取工藝條件溫和化,有助于保持藥效成分的原有性質。比如植物藥經醇處理后,其成分已發生了不同程度的改變或丟失,以至直接影響中藥制劑的藥理作用及療效,用纖維素酶預處理后,可用水或其他溶劑代替醇,從而最大限度地保持藥效成分的原有性質"再如一些植物藥中含特定立體旋光結構的真菌類多糖,在提取中有時需用酸處理,由于酸能破壞多糖的苷鍵而形成較多的單糖和低聚糖,從而使構象。(3)“仿生化提取”是近幾年提出的中藥成分提取的構想。為了克服傳統的高溫煎煮對活性成分藥效的影響,這一構想提出把提取溫度降至接近人體溫度,低溫存在的問題是不利于植物藥纖維素的破壞,纖維素酶能擔此重任,能在低溫下迅速有效地破壞纖維素,有助于實現中藥有效成分的低溫提取。
     誠然,纖維素酶應用于中藥成分的提取是一個比較新的課題。目前仍存在著一些問題,包括纖維素酶活性低的問題,這是制約纖維素酶應用的最大因素。人們已著手選育性能優良的產酶菌株,特別是高溫、廣適pH值等一些極端環境中菌株的篩選,同時也對菌株進行常規理化誘變、基因重組、基因定位突變等方面的工作,以便構建高酶活的菌株,且已有一些成功的報道。
5 展望
     海洋占地球表面積的70%,海洋細菌數量龐大,極具多樣性。與陸地細菌截然不同,海洋菌生活在諸如高鹽度、高壓、低營養、低溫(特別是深海)或局部高溫、無光照以及不同的生物之間等特殊甚至極端環境中,具有獨特的代謝方式,其產纖維素酶的能力與特性有待發掘。海洋細菌產生的酶在高鹽度下有活性,所產纖維素酶能分泌到胞外,并且產酶種類較多。因此,對海洋細菌展開廣泛深入的研究,有希望獲得有較高應用價值的菌株。
     在不久的將來,隨著纖維素酶的研究深入,纖維素酶必將在中藥有效成分的提取中發揮強有力的作用。在中藥現代化進程中,用纖維素酶對中藥進行提取前處理,符合“仿生化提取”的觀念,能改善提取工藝,提高中藥品質,有很好的應用前景。