概述：
織免疫熒光染色多是使用組織的冰凍切片，因為在切片過程中基本上暴露了細胞和細胞核內結構，故不需要使用細胞通透劑(Triton-100,NP-40)。染色后的切片應放置冰箱內避光保存，防止熒光淬滅。常用的熒光素有：異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC,發散蘋果綠色熒光)；四甲基羅丹明異硫氰(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC，發散橘紅色熒光 )
一. 組織處理：
取出組織后，置于4%多聚甲醛中4-12小時（視組織大小、厚度而定），多聚甲醛的體積應為組織大小的5-10倍。再在20%蔗糖中4℃過夜。OCT（冰凍包埋劑）包埋組織，-20℃或更低的溫度進行冰凍。
二．冰凍切片：
切片可于-40或-80℃中保存。
三．染色：
1.冰凍切片使用前放濕盒室溫1小時復溫。
2.用組化筆（可用唇膏代替）在組織周圍劃出范圍，以防止此后操作中液體溢出使得組織切片變干。
3.PBS洗去OCT 及多聚甲醛，用PBS 洗切片，10min×3。
4.0.1%TritonX-100，30min。主要用于細胞打孔，有利于抗體進入細胞。用PBS 洗切片，10min×3。
5.加山羊血清，4℃過夜，主要用于預封閉抗原，減輕背景染色。
6.加一抗，4℃過夜。一抗濃度根據說明書而定，如果無說明，則進行1:50 , 1:100 , 1:200 , 1:400 , 1:800摸索適合的濃度。PBS洗去一抗，10min×3。
7.加熒光二抗，37℃孵育30min或室溫1~2h（此后步驟于暗室操作）。二抗濃度一般1:100或1:200。PBS洗去二抗，10min×3。
8.滴碳酸鹽緩沖甘油于片上，蓋蓋玻片。用透明指甲油封于蓋玻片四周。
9.暗盒中4℃保存切片，共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡觀察結果。
四．試劑配制
1.多聚甲醛和蔗糖溶液均用0.01M的PBS來配制。
2.所有抗體用1%BSA（用PBS溶解BSA）稀釋。如果切片中熒光點難以洗去，則用PBS稀釋抗體。
3.封片所用甘油為甘油緩沖液：甘油（分析純）20ml，加入0.5M碳酸鹽緩沖液20ml，充分混勻，待其中的氣泡完全消失后即可使用。
4.0.5M碳酸鹽緩沖液（pH9.5）的配制：NaHCO3 3.7g ； Na2CO3 0.6g ； H2O 100ml，混合溶解，測定并校正pH值。