組織培養中污染及防止

一、污染的來源

1、 植物本身具有：

（1）植物病原菌  有些作物的病害已被透徹研究，因此在大量繁殖時，可立即檢查出來，但有些則否，造成若有污染時，不知來源為何。

（2）和植物有關的菌類 有修植物本身便會和一些菌種共生，或是寄生于植物內部。

2、 植物所帶入的污染：內在污染源 許多植物表面或大氣中生存的微生物，可經由植物自然的開口或傷口進如植物內部，而有一些兼性腐生菌或絕對寄生菌，可藉由載體或是擁有一些侵入的機制侵入植物內部，依其存在的地方分為

（1）細胞內－inter

（2） 細胞間隙－interacellular     種類有：virus病毒、viroids類病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜綱（ex:mite）、立克次體。

3、 操作室：外在污染源  在組織大量培養下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染來源便是來自操作室。依其可能原因分析為：

（1）空氣  在操作室中，未過濾空氣帶有大量的微生物，隨者操作人員或植株接觸時，而污染培養皿。故在國外對于操作室內空氣的清潔度分為四種等級：

ClassⅠ.沒有容易培養的微生物，和作物之主要病原菌

Ⅱ.沒有容易培養的微生物，和作物特殊病原菌

Ⅲ.沒有容易培養的微生物

Ⅳ.未做檢測

（2）不完全的滅菌設備或技術 因為使用滅菌不完全的設備或是技術，而導致植株或培養皿的污染，例如：有酵母菌，可避免酒精消毒，還有一些會產生內孢子，而避免火焰消毒。

（3）人員 在整個操作室內，人員可說是最大的帶菌者，其不管在毛發或是衣服等，都隱藏屬不清的菌。在進入操作室前，最好能將作業人員清潔處理，然后換上脫鞋，或是將塵土去掉。

（4）細縫的存在 因為若操作室有細縫的存在，則造成外果氣體直接流入，使得空氣中菌數增加。

（5）操作臺上的濾網不干凈 因為使用過久，或不當保養，而造成濾網壞掉，而產生更多的污染。

（6）蹣及薊馬的存在 此為珠形網，具有活動能力，能到處跑來跑去。因此常造成散亂的污染。

4、栽培過程污染 在栽培室，組培瓶外和外界氣體交換時，亦會有污染進入。污染機率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

二、污染的種類及形式

1、 污染的形成 依據污染的來源，可將污染分為三個形式：

（1）由植物內部或病原菌所造成的污染 植物內部或病原菌所造成的污染，所呈現是系統性，及從stageo~stage4中都可發現，而且占有一定的百分比。

（2）在制造時所造成的污染 如因蹣或是空氣中的關系造成的污染，其所表現的方式是散亂（random）性非系統性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是機率性。

（3）技術上的失誤 其呈現方式有一定性，例如由此工作臺所生產得植株都被污染，表現為帶狀性，可用卷標方式來追蹤，以進而改善。

2、污染的來源分類

（1）污染的種類，以總體來說可分為下列幾種：

a.病毒(virus)－常存在植物內部。

b.(viroids)常存在植物內部

c.細菌－在組織培養中又分依其來源和所在地方分類如下：

(a) phlem-eimited生長于韌皮部 xylem-eimited生長于木質部

(b)植物病原細菌 (c)空氣中存在的細菌，但因植物有傷口，或是營養豐富的地方，可分為植物表面的細菌或植物內部的細菌。

例如：Bacillus spp.可抗熱，在不完全滅菌的玻璃器皿中可發現。

(d)菌質體 是一種像細菌的微生物，但是本身沒有細胞壁，可以在培養基培養，亦可用特殊的抗生素（四環霉素）抑制其生長。其種類有microplasm與spiroplasm。

(e)真菌 在植物病害中，真菌所引起的病害特別多且嚴重，且因其會產生孢子，所以會隨著空氣飄散。

一旦落于適當的環境下，一粒小小的孢子便會擴大成一個菌落，污染整個組織培養瓶。例如常見的酵母菌，其菌落為粉紅色，若有其出現，則其污染來源可能來自空氣。

(f)蹣或薊馬 此為細小的微生物，具有活動能力，喜歡吃菌絲。在國內使用期限較久的組培場中常出現此問題。 (g)立克次體 目前未清楚其污染方式。

（2）以培養難易區分污染源

在培養基中易培養菌類 細菌，真菌，蹣。

在培養基中不易培養的菌類 病毒，類病毒，立克次體，菌質體。

在組織培養過程中，常造成污染或是造成威脅的菌類，稱為培養菌類。因常為腐生菌，且營養需求不高（隨便吃，隨便活）所以常造成成本的增加。

而且污染后，常使培養基的pH值降低，洋菜無法凝結，而使植物無法生長或是產生有毒物質或副產品，使得植物生長緩慢，或是干脆就在植物上生長。在培養基上不易培養或是不能培養的菌種，就不會造成太大的威脅。

（3）各種菌種其主要傳播方式

病毒，類病毒，菌質體－常利用機械或利用有載體傳播。

細菌－可經人力，氣流或水，及昆蟲等傳播。

真菌－亦同上，但孢子可經空氣傳播。

薊馬－同上，具活動力，自由運動，應慎防出現。

（4）依其菌落生長出現的快慢區別

可見的菌落在組織培養中。一些易培養的菌類，其生長特性為快速蔓延整個組培瓶。但此種污染可利用工作人員之視覺觀察將之偵測出來將之銷毀，對后代植株造成威脅不大。

 潛藏的菌落－在組織培養中有些不易培養或是在植物內部寄生或共生的菌類或病原菌，在培養時沒有表現出來，但是有存在或只有很微弱的表現，但是未被察覺出來。于是便造成了對后代植株的重大威脅及成本的增加。

其污染未明顯表現出的原因有下列幾項：

在培養基中含有抗生素，則菌類不易生長。.

在培養基中，因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如：單寧酸，因此抑制菌類表現。

培養基成分不適合其大量表現，可能因營養需求不同。

本身菌類生長方式不同： 例如病毒為絕對寄生菌，無法在一般培養基中培養。

（5）依其植物棲息的地方分為：

植物表面棲息的菌類 如：細菌，真菌。

在植物內部共生寄生的菌類： 如：病毒，類病毒，細菌，真菌，菌質體。

在大氣中游移的菌種 細菌，真菌，蹣。

三、污染種類的鑒定方式

1、針對培養難易菌種鑒定方式

（1）針對易培養的菌種：其種類為真菌，細菌

就真菌而言，主要是利用顯微鏡，視其孢子形態、產孢結構、及菌絲有無隔膜、還有細胞壁之形成加以鑒定。目前亦有使用DNA探針加以分析。

就細菌而言，則是利用其特殊的生化反應，或是利用選擇性的培養基。目前亦有如用fatty acid profiling技術和商業化的test kits加以鑒定。

（2）不易培養的菌種，如菌質體，病毒，類病毒。

就菌質體而言，主要是觀察其在培養基上菌落的形態。

病毒而言，分析其核酸的組成與例子的外形。

類病毒因沒有套膜，以上兩種常利用其DNA有同源性而做探針偵測。

（3）病原菌的偵測 利用柯霍氏法來測其病源性。而利用分子診斷，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探針以鑒定種類。

2、一般對細菌的基本測試

a.Gram stain     b.形狀     c.游動性     d.催化酵素的測試     e.氧化酵素的測試     f.熱穩定性     g.行氧化作用或發酵作用

四、針對污染源常使用的防治方法

（1） 種類

熱療－對病毒較有效但須花費時間。處理時，需6-12星期在30-40℃。

冷療法－亦對病毒有效。

利用抗生素。

以分生組織，不帶病毒等污染源。

利用培養基中高糖，高鹽的濃度。

利用抗并毒藥物。

營養需求不同。

利用水。

抽樣檢測。

（2） 防治方法之效果討論

a  熱療法及冷療法 對病毒有效，但須花時間處理，例如：熱療法處理時間需花6-12星期在30-40℃。

b  利用抗生素 這是目前較常用的方法，但是在抗生素加入培養基，其有效濃度常因植物具有半滲透功能，而使濃度無法達到有效濃度。

使用抗生素時，需注意下列事項：

要知道抑制的微生物為何，再使用抗生素，及對癥下藥。

要決定最小抑制濃度，以降低成本。

要確定抗生素不會對植物造成并害或突變。

確定抗生素在培養基上是否有作用。

使用時，常因需要而多種混合或交替使用。

有些抗生素在某些國家是禁止使用，使用前必須做詢問此藥劑是否合法使用。

使用抗生素的缺點: 可能對哺乳類動物有害; 若是使用生長期較長的植物，微生物亦有抗藥性產生; 容易錯誤使用, 沒有針對微生物而使用各種不同的抗生素。

抗生素的種類及對象

抑制細胞壁合成:

Bactracin G(+)，殺菌，對抗β-lactams的菌有作用

β-lactams G(+)，殺菌，若用10-100倍，則對G(-)有效

Glycopeptides G(+)，殺菌，但很貴，不易有抗藥性

抑制膜的形成 plymixins 對G(-)Psedomonas spp.有效

抑制蛋白質的合成:

Ghloramphrnical 殺菌作用，便宜，但對植物有毒害作用

Aminoglycosides 使用對象廣泛，對植物有毒害作用，在堿性環境下較有活性可針對G(-)可和盤尼西林(pencillins)一起作用

Macrolides and 對G(+)有靜菌作用

Tetracyclines 為靜菌作用，對G(+)、G(-)都可以會刺激酵母菌，植物有害對

核酸抑制物質:

Qutnolnes 殺菌，對 G(+)有效，10-100倍濃度則對G(-)有效，有抗藥性產生，可引起過敏反應易

Rifampicin 殺菌，對一些G(+)或G(-)的細菌有作用，但常有抗藥性產生

Trimethoprim 對于一些 G(+)或G(-)的細菌有作用，Trimethoprim

Sulphonamides Sulphonamides兩種混合使用有加強的作用

Sulphonamides在堿性環境下較活躍

c  分生組織法 主要是針對在植物內部寄主的菌類，如病毒等。因其生長速度無法長到頂芽的分生組織，所以在頂芽的分生組織則無病原菌存在。可以利用此分生組織培養成植株即可避免感染問題。

d  利用培養基中高鹽或高糖的濃度 在培養基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物生長，或有單寧酸的存在時也可以達到抑制效果。

e  利用抗病毒藥物  Ribaririn－對于ssRNA病菌有抑制作用，但是價格昂貴。

f   營養需求不同 因為不同的菌類其營養需求不同，因此可利用選擇性培養基可篩選或抑制一些微生物。

g  利用水淹 利用水將植株清洗或是完全浸沒，以避免其上的接種源四處擴散。

h  抽樣檢測 對于后代植株的抽樣檢測，可將污染嚴重的個體去除。以上這些方法可以綜合使用，以建立一個清潔的植株。

五、污染所造成的結果     

1、生產成本的提高。   

2、對植株造成傷害。

3、增加接種源及污染的機率。

六、在組織培養過程各個階段所應注意事項

stage0： 建立干凈的植株，以利下面階段的作業進行。只要建立無菌的植株，則污染的來源便只是來自技術上的失誤。因此在此階段要將病株丟除，并且將其具較多污染源的植株去掉。一般會選擇較成熟的植株，因其病征易顯現找到植株后。分離其菌或病原菌，做系列稀釋以決定濃度。

stageⅠ：在stageⅠ的污染可蔓延培養基，故可利用“視覺”將之選出或丟棄，對于潛伏性或是表現微弱的菌種，需作特別的測試，在此階段，要對一般的微生物作測試及對已知的病原菌作測試，若兩種為負便可進入stageⅡ。stageⅡ要把污染的植株去掉，知道病原菌并重復分生組織的培養。

stageⅡ：在此階段中，只有無菌的植株可繁殖。假設此植株為無菌，則污染源便來自操作室，故要先丟掉污染后，然后再取樣抽檢。

stageⅢ：如同stageⅡ。

stageⅣ：對后代植株需取樣檢查。