細胞和亞細胞提取物的制備實驗6

利用細菌獲得用于純化的重組蛋白是非常方便的。適用于細菌細胞蛋白提取的方法包括超聲波處理、玻璃珠研磨、釩土或石英砂研磨、French 加壓罐高壓剪切細胞和溶’菌酶處理。這些方法適用于從各種革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中制備蛋白提取物。通常是使用酶的方法破壞細胞，因為細胞在懸浮液中能獲得相對均一的處理。下面講述酶裂解 E.coli 的方法。

表達目標重組蛋白的細菌細胞

二硫蘇糖醇（DTT)裂解緩沖液DNase I1XLaemmli 樣品緩沖液溶菌酶（雞蛋）MgCl2NP-40

離心機韋林攪切器

1.4°C、3000 g 離心 15 min 收集細菌。

2.用裂解緩沖液洗細胞，除去殘留的培養基。重復步驟1，離心收集洗過的細胞。

3.倒出上清，稱沉淀的濕重。

4.每克細胞沉淀用約 3 ml 裂解緩沖液重懸，4°C 條件下攪動懸浮液 30 min。如果沉淀物在 30 min 后沒有完全懸浮，用韋林攪切器低速混合懸浮液 1min。

5.加溶菌酶至終濃度 1g/L，并在 4°C 條件下孵育 35 min，溫和振蕩。

增加溶菌酶的濃度至 10 mg/ml，可以加速裂解。如此，在 4°C 條件下，5 min 就可以獲得充分的裂解（Bollag，etal，1996)。

6.按順序加人如下試劑：

NP-40 至終濃度 5 g/L

MgCh 至終濃度 5 mmol/L

DNase I 至終濃度 40 ug/ml

4°C 攪動懸浮液 30 mm，除去黏性的核酸。

細菌提取物包含 40%~70% 蛋白、10%~30% 核酸、2%~10% 多糖和 10%~15% 脂類（Worral，1996)。細胞裂解過程中 DNA 的釋放經常導致提取物高度黏稠，這可能在接下來的層析純化步驟中引起嚴重的麻煩。除了用 DNase I 處理外，也可以加人帶正電荷的化合物，如魚精蛋白硫酸鹽 (至 5 mg/g 沉淀濕重）（Scopes,1994) 或聚乙稀亞胺，通過中和溶液來除去細胞提取物中的 DNA(還伴有其他核酸，在一些情況下，還有高度酸化蛋白）（BurgossandJendrisak，1975)。

實驗提示：用帶正電荷的化合物除去 DNA 的方法不能用于包含體的提取。因為沉淀的 DNA 將與包含體一起被離心下來。

7.懸浮液在 4°C 條件下 23000 g 離心 30 min。

8.用含有 DTT 的 Laemmli 緩沖液重懸一小部分沉淀。

9.利用分析級 SDS-PAGE 分析可溶性蛋白組分（上清）和沉淀組分，找出目的蛋白存在的位置（見方案 1)。

如果目的蛋白位于難溶的沉淀組分中，則可能是形成了包含體，那么目的蛋白就需要依照實驗方案 7 來溶解和純化。若目的蛋白位于上清中，則將其貯存于 4°C，以備后續純化方案使用。