細胞免疫熒光染色

實驗概要

細胞免疫熒光染色

實驗原理

利用抗原抗體反應，鑒定細胞是否表達某種蛋白。細胞經固定后，用特異性抗體（一抗）識別目的蛋白，再用一抗的抗體（二抗）識別一抗，二抗一般耦聯熒光基團或化學反應基團，通過熒光或化學發光顯示目的蛋白。

主要試劑

防淬滅劑、DPBS、指甲油、4% PFA、10 μg/mL PI、10 μg/mL Hoechst 33342、封閉液、BSA、Triton-X100

主要設備

玻璃片、細胞培養皿、激光共聚焦顯微鏡

實驗步驟

①將潔凈無菌的玻璃片放在細胞培養皿底部中央，接種細胞，待細胞生長到合適密度時，棄培養液，室溫用4% PFA固定細胞。
注意：細胞固定時間取決于染色的細胞類型，單層細胞需要固定10 min左右，mESCs和hESCs需要20 min左右，如果是胚胎或者擬胚體（Embryoid Bodies, EBs）需要30 min以上。
②洗滌：吸棄4%PFA，然后用DPBS洗3次，每次5 min。
③通透：用0.5% Triton-X100室溫通透細胞。
注意：1. 細胞通透時間取決于染色的細胞類型，單層細胞需要通透10 min左右，小鼠胚胎干細胞和人胚胎干細胞需20 min左右，如果是胚胎或者擬胚體需要30 min以上。
      2. 膜蛋白的抗體染色可以不用通透。
④封閉：加入足夠量的封閉液，確保覆蓋住所有細胞，室溫孵育1 h。
⑤加一抗：棄去封閉液，加入用抗體緩沖液稀釋的一抗（具體稀釋倍數參考相應的抗體說明書），用封口膜封好培養皿，4℃過夜。
⑥吸棄一抗，用洗滌緩沖液洗3次，每次5 min。
注意:1.為避免非特異性結合，至少洗3次，每次5 min，在搖床上搖動洗滌。
     2.每個孔換一個槍頭，避免抗體交叉污染
⑦加二抗：加入用抗體緩沖液稀釋的二抗（具體稀釋倍數參考相應的抗體說明書），避光、室溫放置1 h。
⑧用洗滌緩沖液洗3次，每次5 min。
注意:為避免非特異性結合，至少洗3次，每次5 min，在搖床上搖動洗滌。
⑨染核：用10 μg/mL Hochest33342溶液覆蓋細胞20 min。
⑩加入洗滌緩沖液，在搖床上搖動洗滌1 min。
?封片：每張玻片上加5 μL防淬滅劑，用蓋玻片傾斜覆蓋于組織上，避免產生氣泡，用指甲油小心地在蓋玻片四周輕涂，使蓋玻片與玻璃片黏合
?激光共聚焦顯微鏡下拍照。