細胞的凍存與復蘇實驗_液氮凍存法

目前長時間保存細胞的方法是將細胞低溫凍結保存在液氮中（－196 ℃），保存時間可長達一年甚至幾年，用時解凍，大多數細胞仍能生長繁殖，為妥善起見，細胞凍存一年后應復蘇培養后再凍存。凍存細胞時應加入保護劑，否則，細胞內外的水會結成冰晶，使細胞發生機械損傷。加入保護劑后，可使冰點降低，在緩慢凍結的條件下，細胞內的水分在凍結前滲出到細胞外，避免冰晶的損傷。目前常用的保護劑為甘油和二甲基亞砜（DMSO），它們對細胞無毒，分子量小溶解度大，易穿透細胞，使用濃度甘油為10％～20％，二甲基亞砜5％～15％，常用為10％。另外，凍存液中還要加入培養液，以提供營養，滲透壓，pH。細胞復蘇指融化凍存的細胞，重新培養。解凍細胞速度要快，使之迅速通過最易損傷的－5～0 ℃。

對數生長期細胞

消化液培養液甘油DMSO酒精水

吸管離心管凍存管培養瓶記號筆紗布小口袋溫度計砂輪

一、細胞凍存

1.  細胞懸液制備

選對數生長期細胞，10 ml 培養瓶面，幾乎成單層時可凍存一管；收集細胞24 小時前換液一次；按傳代方法制成細胞懸液。

2.  收集細胞

將細胞懸液移入無菌離心管中，1000 rpm，離心5 分鐘，去上清。

3.  凍存液

將培養液和甘油按9：1 的比例配成10％的凍存液，取1～1.5 ml 到離心管中，輕輕吹打使細胞懸混。

4.  裝瓶

用吸管吸取細胞懸液1.5 ml，裝入安瓶中，盡量不使液體碰到安瓶口。

5.  封口

將安瓶在火焰最熱處封好，如用凍存管將蓋兒擰緊即可。

6.  標記

用記號筆記好細胞名稱，凍存年月日。

7.  凍結和保存

將安瓶裝在紗布袋中，置4 ℃ 2～4 小時，－20 ℃ 2～4 小時，液氮的氣相部分－130 ℃～－180 ℃，浸入液氮。液氮量一定要充分，以使溫度恒定。

二、細胞復蘇

1.  用大鑷子取出液氮中的安瓶，投入盛有37～42 ℃的水中，不時搖動，使之快速通過－5～0 ℃。

2.  在超凈臺中，用砂輪擦安瓶頸并用酒精棉球消毒，打開安瓶，吸出細胞懸液裝入培養瓶中，并以10×稀釋，放CO₂ 培養箱中進行培養，第二天換新鮮培養液，以換掉凍存劑。

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。

細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。

來源《中國醫科大學實驗指導手冊》