細胞凋亡檢測實驗

本實驗用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導培養的HL-60細胞發生凋亡，同時也有少數細胞發生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區別凋亡、壞死及正常細胞。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現出典型的凋亡特征。

細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質膜。當細胞壞死時，質膜不完整，PI就進入細胞內部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合（主要結合于A-T）堿基區），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

人早幼粒白血病HL-60細胞

三尖杉酯堿 Tris-Hcl EDTA緩沖液 堿性裂解液 SDS 醋酸鈉 異丙醇 乙醇 溴酚藍 蔗糖指示劑 TBE電泳緩沖液 瓊脂糖 溴乙錠 PI母液 Ho33342母液

熒光顯微鏡 電泳儀 電泳槽 微量加樣器 離心管 載玻片 蓋玻片

一、試劑準備
 

1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

5.  醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

6.  PI母液：500μg/ml；

7.  Ho33342母液：2mmol/L；

8.  人早幼粒白血病HL-60細胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培養基在37℃，5% CO₂條件下培養。

9.  其他：異丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚藍、蔗糖指示劑、TBE電泳緩沖液、1%瓊脂糖、溴乙錠。

二、三尖杉酯堿誘發HL-60細胞凋亡

1.  實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6 ml培養液，置37℃，5%CO2培養箱培養。

2.  實驗前約2.5小時，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200 μl，使終濃度為1 μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5小時。

3.  Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞

（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取200 μl于1.5 ml的離心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分鐘。

（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10 μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發光，高倍鏡下觀察，區別三種細胞，并注意三者比例。

1.  誘導培養HL-60細胞時間要準確；

2.  熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。

細胞死亡根據其性質、起源及生物學意義區分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態學和生物化學特征。

在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。

在生物化學上，多數細胞凋亡的過程中，內源性核酸內切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質膜崩解釋放出其中的內容物，引起炎癥反應，壞死過程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時，也可產生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。