細胞凋亡檢測實驗

實驗方法原理 細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生。如老年性癡呆與神經細胞凋亡過度有關，自身免疫性疾病和腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別于細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細胞膜的內側，但在凋亡的細胞，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此將Annexin-Ⅴ進行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

實驗材料 Annexin V-FITC

試劑、試劑盒 標記緩沖液PBS去離子水冰塊

儀器、耗材 移液器吸頭微量離心管可調速離心機載玻片蓋玻片流式細胞儀或熒光顯微鏡

實驗步驟

1.  凋亡細胞的制備

小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調整待測細胞的濃度為2×106 /ml，備用。

2.  200 μl細胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。

3.  重復步驟2兩次。

4.  將細胞重懸于200 μl 標記緩沖液。

5.  加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應15 分鐘或4 ℃反應30 分鐘。

6.  加入300 μl標記緩沖液，立即上機（流式細胞儀）檢測。

注意事項

1.   整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4 ℃下操作。

2.  反應完畢后要盡快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應一小時后熒光強度就開始衰變。

3.  Annexin V-FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。

其他

一、實驗結果

用熒光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環。PS轉移到細胞膜外不是調亡所特有的，也可發生在細胞壞死中。以FITC標記的Annexin V, 可以同時結合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。