細胞凋亡檢測方法介紹

細胞凋亡是指細胞在生長到一定階段及某些生理過程中，會受到多因素和機制的嚴格調控而進入死亡。這是一個動態的過程,會涉及一系列復雜的生化反應, 是一個需要酶參與的級聯反應,同時也涉及不同基因的表達及調控、信號傳導。其中有幾項生理過程能被用來檢測凋亡的發生，因此多參數分析法對于準確檢測這一過程十分重要。同時，了解細胞死亡和存活機制也是毒理分析和藥物研發應用中一個非常關鍵的內容。 Sigma?聯合Roche?提供多種分析細胞凋亡的研究方法。包括：Caspase活性檢測；DNA片段化分析和檢測；膜變化檢測（AnnexinV染色、膜電位、線粒體功能完整性分析檢測實驗）及細胞形態學檢測。

Caspase活性檢測

Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases)是一個家族的蛋白酶，它的活化是細胞凋亡的典型特征。一旦一個Caspase 酶被激發，就會激活一系列其他的Caspas酶,裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。Caspase 3 活化發生在凋亡早期，并在凋亡過程中起重要作用。Caspase 3 Activity Assay (CASP3C) 基于熒光免疫酶測定，能在體外特異性地對Caspase 3進行定量。

膜變化檢測

凋亡細胞另一個生化特征是細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸從胞質轉至胞外。膜聯蛋白中的Annexin V，是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有強親和力。通過使用Annexin V FLUOS Staining Kit (11988549001) 或Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (APOAF) 方法進行凋亡細胞早期檢測。可使用流式細胞儀或熒光顯微鏡監測。同時使用PI，根據細胞膜的通透性區分早期凋亡細胞和壞死細胞。 線粒體膜電位和膜通透性的變化也是凋亡細胞一個重要特點。可使用Cytochrome c Oxidase Assay Kit (CYTOCOX1) 試劑盒檢測凋亡細胞線粒體所釋放的細胞色素C。也可使用Mitochondria Isolation Kit 1 (MITOISO1) 分離凋亡細胞線粒體，其膜電位可通過Mitochondrion Membrane Potential Kit (MAK146-1KT) 檢測。

DNA片段化分析

DNA降解也是細胞凋亡的典型標志之一,其降解產物可分為兩種，即高分子量的單鏈DNA缺口以及低分子量DNA片斷(單鏈及寡聚核小體)。單鏈DNA缺口有特定的檢測方法，即利用酶催化，將特定核酸標記到游離的3'-OH末端，這種方法被稱為 TUNEL。Roche提供的基于TUNEL法的In Situ Cell Death Kit, fluorescein （11684795910）能夠在組織及單細胞中檢測到低水平的凋亡，靈敏度高，背景干擾小，且可通過后續的流式、熒光顯微鏡、光學顯微鏡檢測對細胞凋亡進行定量。 在凋亡細胞的細胞質中出現的組蛋白聯合的DNA片斷(單鏈及寡聚小體)，可使用Cell Death Detection ELISAPLUS（11774425001）高通量地檢測細胞死亡，或使用Apoptotic DNA-Ladder Kit （11835246001）通過純化及瓊脂糖電泳分析這些呈現出典型的ladder狀態的DNA片斷。

細胞形態學檢測

細胞形態的變化如胞膜皺摺或出泡、核染色質致密、胞質濃縮等，都可作為細胞凋亡的證據。一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342 (B2261)，Hoechst 33258 (B2883), DAPI (D9542)。三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。