細胞調亡的流式細胞儀檢測技術
一、固定細胞的染色方法
1 ） PI 單染色法
方法一
1． 收集細胞（ 1 ～ 5 ）× 106 個， 500 ～ 1000r/min 離心 5min ，棄去培養液。
2． 3ml PBS 洗一次。
3． 離心去 PBS ，加入冰預冷的 70 ％的乙醇固定， 4 ℃， 1h 。
4． 離心棄去固定液， 3ml PBS 重懸 5min 。
5． 400 目的篩網過濾 1 次， 500 ～ 1000r/min 離心 5min ，棄去 PBS 。
6． 用 1ml PI 染液， 4 ℃避光 30min 。
7． 流式細胞儀檢測： PI 用氬離子激發熒光，激發光波波長為 488nm ，發射光波波長大于 630nm，產生紅色熒光，可分析前散射光對側散射光的散點圖及 PI 熒光的直方圖。
方法二
1． 收集細胞（ 1 × 106 個）， 500 ～ 1000r/min 離心 5min ，棄去培養液。
2． 1ml PBS/FCS 洗一次。
3． 500 ～ 1000r/min 離心 5min 去 PBS/FCS ，加入 500 μ l PBS/FCS 和 500 μ l 的多聚甲醛固定液，輕輕混勻，在 4 ℃下固定 4min 。
4． 500 ～ 1000r/min 離心 5min 棄去固定液，室溫加入含 0.2 ％ Tween 的 PBS 1ml ， 37 ℃孵育15min 。
5． 1ml PBS/FCS 洗 3 次，每次 5min 。
6． 400 目的篩網過濾 1 次。
7． 500 ～ 1000r/min 離心 5min 去 PBS/FCS ，用 1.0ml PI 染液， 4 ℃避光至少 30min 。染色在24h 之內皆可行，流式細胞儀分析。
2 ）調亡細胞的 TUNEL 的流式細胞儀分析
1． 離心收集細胞， PBS 洗 1 ～ 2 次。
2． 1 ％多聚甲醛低溫下固定 15min 。
3． 3ml PBS 洗 1 次， 70 ％乙醇固定，冰箱內放置 1 ～ 3 天。
4． PBS 輕洗 1 次
5． 細胞與 TdT 標記液 37 ℃孵育，時間 1 ～ 2h 。
6． PBS 輕洗 1 次。
7． 細胞在黑暗中 37 ℃與 100 μ l 的染色緩沖液孵育 30min 。
8． 含 0.1 ％ Triton-X 100 的 PBS 輕洗 1 次。
9． 1ml PBS （含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A ）重懸。
10． 流式細胞儀分析紅色（ PI ）對綠色熒光（ FITC ）的地形圖。
3 ） ISNT 的流式細胞儀分析
1． 離心收集細胞， PBS 洗 1 ～ 2 次
2． 1 ％多聚甲醛低溫下固定 15min 。
3． 3ml PBS 洗 1 次， 70 ％乙醇固定，冰箱內放置 1 ～ 3 天。
4． PBS 輕洗 1 次。
5． 2 × 105 細胞與 12.5 μ l 的缺口平移緩沖液在 15 ℃共孵育 6h ，每過 15min 振動 1 次。
6． PBS 輕洗 1 次。
7． 細胞在黑暗中 37 ℃與 100 μ l 的染色緩沖液孵育 30min 。
8． 含 0.1 ％ Triton-X 100 的 PBS 輕洗 1 次。
9． 1ml PBS （含 5mg/ml PI, 0.1% RNase A ）重懸。
10． 流式細胞儀分析紅色（ PI ）對綠色熒光（ FITC ）的地形圖。
二、非固定細胞的染色方法
1 ） Hoechst 33342/PI 雙染色法
1． 懸浮生長的細胞在培養狀態下加入 Heochst 33342 ，終濃度為 1 μ g/ml ；帖壁生長的細胞用含有 0.02 ％ EDTA 的 0.25 ％胰蛋白酶消化成單細胞懸液，離心，棄上清，用 1ml 全培養液重懸細胞，加入 Heochst 33342 ，終濃度為 1 μ g/ml ， 37 ℃孵育 7 ～ 10min 。
2． 4 ℃ 500 ～ 1000r/min 離心棄去染液。
3． 加入 1.0ml PI 染液， 4 ℃避光染色 15min 。
4． 400 目的篩網過濾 1 次。
5． 流式細胞儀分析。
2 ） Annexin V/PI 雙染色法
1． 細胞收集：懸浮細胞直接收集 10ml 的離心管中，而帖壁細胞先用滴管輕輕吹打，調亡細胞一經吹打可能脫壁，收集到 10ml 的離心管中，沒脫壁的細胞用 0.02 ％的 EDTA 消化使之脫壁，每樣本細胞數為（ 1 ～ 5 ）× 106 ， 500 ～ 1000r/min 離心 5min 棄去培養液。
2． 用孵育緩沖液洗 1 次， 500 ～ 1000r/min 離心 5min 。
3． 用 100 μ l 的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育 10 ～ 15min 。
4． 500 ～ 1000r/min 離心 5min 沉淀細胞，孵育緩沖液洗 1 次。
5． 加入熒光溶液 4 ℃下孵育 20min ，避光并不時振動。