細胞分離純化技術

淋巴細胞分離液 血清 肝素

肝素 Hank's液 PBS

滴管 吸管 針頭 碘酒 酒精 棉球 止血帶 計數板 顯微鏡 離心機

1.  在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。

　　
2.  取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000 rpm×20 分鐘。

　　
3.  離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。

　　
4.  用毛細血管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5 倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500 rpm×10 分鐘，洗滌細胞兩次。

　　
5.  末次離心后，棄上清，加入含有10 ％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2 ％臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。

　　　　　　　　　                                 4個大方格內細胞總數

單個核細胞濃度（細胞數/1 毫升細胞懸液）＝────────×10⁴×2（稀釋倍數）

                                                                               4

　　
6.  細胞活力檢測

死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。

　　　　　　   活細胞數

活細胞百分率＝──────　×100 ％

　　　　　　　總細胞數
 

用本法分離PBMC，純度在90 ％以上，收獲率可達80～90 ％，活細胞百分率在90 ％以上。　

1.  抽取人外周靜脈血時要注意無菌操作。

　　
2.  操作全程應盡可能短時間內完成，以免增加死細胞數。

　　
3.  用淋巴細胞分離液分離PBMC時，離心機轉速的增加和減少要均勻、平穩，使保持清晰的界面。

　　
4.  小鼠、兔等動物淋巴細胞比重與人不同，配制相應密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

一、附錄

1.  Hank's液（無Ca^2＋、Mg^2＋）配制法

NaCl 8.0 克，KCl 0.4 克，Na₂HPO₄·12H₂O 0.12 克，KH₂HPO₄0.06 克，葡萄糖1.0 克，雙蒸水1000 毫克，1％酚紅液2 毫克

　　
將上列成分混合后溶化，分裝于500 毫升鹽水瓶內，8 磅15 分鐘滅菌，4 ℃冰箱保存，臨用時調PH至7.3～7.6。

　　
2.  細胞分層液配制法

9 ％聚蔗糖24 份，34 ％泛影葡胺10 ％

　　
混合，測比重為1.077～1.078，G5玻璃濾器過濾除菌。4 ℃冰箱保存備用。

　　
3.  磷酸緩沖液（PB）

原液

A液

0.2 M NaH₂PO₄溶液，NaH₂PO₄ 27.6 克，或NaH₂PO₄·2H₂O 31.2 克，蒸餾水，溶解至1000 毫升

　　
B液

0.2 M Ha₂HPO₄溶液，Ha₂HPO₄·12H₂O 71.6 克，蒸餾水溶解至1000 毫升　

各種不同PH值PB的配法

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　PH　　　　7.0    7.2    7.4    7.6   7.8   8.0

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A液（ml）     39.0  28.0  19.0  13.0  8.5  5.5

B液（ml）     61.0  72.0  81.0  87.0 91.0 94.5

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舉例
0.1 M 　PH7.2PB

A液28 毫升，B液72 毫升，加蒸餾水100 ml

　　
4.  血球保存液

　
葡萄糖2.05 克，枸椽酸鈉0.8 克，氯化鈉0.42 克，蒸餾水100 毫升

　
將上述成分混勻，略加溫使其溶解，分裝小瓶（100毫升）。經10 磅、10 分鐘高壓滅菌。4 ℃保存備用。

　　
5.  培養液配置

（1）RPMI-1640培養液
 

RPMT-1640（FLOW公司出品）1 袋，三蒸水1000 毫升，電磁攪拌30 分鐘：1N HCl 調PH7.2～7.4（約加2.5 毫升），過濾除菌，作無菌試驗，4 ℃保存。

　　
（2）不完全RPMI-1640培養液
 

RPMI-1640 95 毫升，0.1M丙酮酸鈉 1 毫升，0.2 M谷氨酰胺 1 毫升，1 M　Hepes 1 毫升，7.5 ％ NaHCO₃ 1 毫升，青霉素、鏈霉素（各1萬單位）1 毫升

　　
（3）完全RPMI-1640培養液
 

不完全1640培養液90 毫升，滅活胎牛（或新生牛）血清10 毫升