細胞原代培養實驗——組織塊直接培養法

孕鼠新生小鼠

RPMI1640培養基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素鏈霉素

培養瓶青霉素瓶廢液缸血球計數板蠟盤手術器械大頭針離心管小玻璃漏斗三角燒瓶平皿吸管試管移液管無菌紗布無菌眼科剪

一、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。
 

二、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
 

三、用手術剪將肝臟剪成小塊（1 mm²），再用Hank's液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。
 

四、將組織塊轉移到培養瓶，貼附與瓶底面。

五、翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。

六、于37℃靜置3-5小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。

1.  嚴格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。

2.  嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。

3.  吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。

4.  離心管入臺前，管口、管壁應消毒。

5.  實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。

6.  使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。

7.  器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。經火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。

8.  超凈臺內溫度、濕度較大，在夏天工作時臺內散熱更慢，因此進行細胞懸液混勻、接種時，離火焰要稍微遠些。

一、操作要領

1.  混勻操作要領

（1）火焰消毒吸管，用Hank's液冷卻和濕潤管內壁（這是因為剛分離的組織細胞易粘在管壁上）。
 

（2）吸管頭插入管底。
 

（3）用吸管反復輕輕吹打組織塊。
 

2.  器械的使用
 

（1）用工作臺消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。
 

（2）器械置無菌干紗布內嚓一下。迅速通過火焰，冷卻后使用。
 

（3）用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。
 

（4）器械按浸泡消毒的順序使用。
 

（5）各套再消毒器械不可混用。
 

3.  除去組織塊多余水分
 

用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向對側的多余水分。

注意：多余水分若不除去，會使組織塊剪切不細，消化后的細胞懸液清亮（細胞數少），并可見消化液中有線狀或絮狀物漂浮。
 

4.  細胞計數

（1）用吸管混勻待計數的細胞懸液。
 

（2）將一小滴細胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細胞計數池中。
 

（3）沉降1分鐘，低倍鏡下計數血球計數板四大中格的結構完整的細胞，小細胞團計數為1。
 

（4）計數時，如果細胞壓在格上，則數上不數下，數左不數右。然后按下式計算出每毫升懸液中的細胞數。

（四大中格細胞數/4）*10 000=細胞數/毫升