◇濕熱消毒的注意事項
①不可用安全閥摘子排氣。
②消毒的過程中若出現漏氣現象，可調節消毒器蓋內的膠墊的位置。
③滅菌完畢，不要急于取出消毒品，可利用消毒器的余熱去除物品部分濕氣，待半小時左右再移入干燥箱烘干。
這種消毒方法主要用于玻璃器皿消毒，一般溫度在160℃維持90—120分鐘就可以殺死芽胞，達到消滅包括細菌、芽孢在內的一切微生物的目的，還可破壞熱原質。消毒完畢，待烘箱內溫度冷卻后再開門，避免因冷空氣突然進入，烘箱內溫度驟降引起玻璃器皿損壞。
紫外線直接照射消毒是各實驗室常用的方法，主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒。進行室內消毒時，紫外線燈應距地面2．5米，使各處有0．06微瓦能量的照射。當室內有塵土時，殺菌能力減弱，故其消毒環境應清潔無塵，并要求消毒空氣濕度小于50％，才能達到殺菌效果。紫外線消毒時產生臭氧，對身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。目前有的實驗室采用電子滅菌燈代替紫外燈進行空氣消毒。
大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。常用的除菌濾器有正壓式和負壓式兩種。
◇正壓式(加壓式)濾過消毒。
正壓式除菌濾器為金屬結構，中間墊一種特制的混合纖維素酯微孔濾膜，其過濾速度較快，效果較好，被多數實驗室采用。濾膜孔徑有0．6微米、0．45微米、0．22微米三種規格。濾過除菌時，常使用0．22微米孔徑的濾膜。濾器上下層各有一槽，放置硅膠墊圈，將濾膜壓緊固定。
濾膜使用時應注意：
①濾膜薄且光滑，容易移動，安裝時膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時易破裂，因此安裝前可先用三蒸水潤濕濾膜。
②為保證過濾效果，在使用時，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為0．45微米，下面一張孔徑為0．22微米，或兩張均為0．22微米。
③使用無齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。
④加大壓力時用力應均勻，用后打開濾器對光檢查濾膜是否移動和有無破裂。
⑤濾器濕熱消毒，37℃干燥。濾膜用后丟棄。若過濾少量液體，可將小型針頭濾器安裝在注射器上使用。目前許多廠家有一次性針頭濾器出售。國產針頭濾器易污染。
⑥不同廠家的濾膜質量有差異。
◇負壓式濾過消毒
負壓式濾過消毒常使用玻璃濾器。玻璃濾器以燒結玻璃濾板固定在一玻璃漏斗上做成，適于各種培養液的濾過除菌，但不宜濾過血清等粘稠液體，因為容易堵塞濾板孔。根據濾板孔徑大小分為G0—G6幾種規格，一般使用G6型(孔徑為0．22微米)除菌。玻璃濾器漏斗接抽濾瓶，膠管連接抽濾瓶和抽氣瓶，抽氣瓶再與真空抽氣泵相連，或 抽濾瓶用膠管與玻璃水泵相連。負壓式濾過消毒的缺點是濾速較慢，清洗過程繁瑣。
負壓式除菌濾器安裝使用注意事項：
①漏斗與抽濾瓶連接部位要旋緊，并用消毒布包緊連接部位，以保證瓶口不漏氣。
②當抽濾瓶內有負壓形成時，先夾緊抽濾瓶下口與抽氣瓶連接的膠管，再緩慢停止抽氣，防止有菌空氣倒回，污染濾液。自然濾過一段時間，待流速減慢可再行抽氣。
③當漏斗中剩余液體為50～100毫升時，夾緊下口膠管停止抽氣，空氣隨液體自然濾過消毒進入瓶內，瓶內壓力升高，真空解除。
④拆除真空泵和抽氣瓶連接裝置，拆除漏斗與抽濾瓶連接部包布。
⑤漏斗與抽濾瓶連接部位在火焰前方均勻燒灼后，兩者分開，抽濾瓶斜放在超凈臺上，瓶口順風向。
75％酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。0．5％的過氧乙酸在10分鐘內可將芽孢菌和各種病毒殺死；乳酸蒸汽常用做無菌室內或周圍環境的定期消毒；75％酒精常用于超凈臺的臺面、器械、實驗操作者的皮膚等的消毒，0．1％新潔爾滅用于對桌、椅、地面、皮膚、操作臺面進行擦拭或浸泡消毒；0．1％洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。
塑料器皿不耐高溫，清洗干凈后用75％酒精(分析純)浸泡過夜，滅菌三蒸水浸泡兩次，每次10分鐘，紫外線照射1小時，再經細胞基礎營養液浸泡過渡后，供短期內使用。
大包裝塑料器皿或不能用上述方法消毒的試劑，可用電離輻射消毒。電離輻射消毒方式有兩種：一種是用2．5百萬拉德60Co產生的γ射線照射48～72小時；另一種是用大于5百萬電子伏特的高能電子束照射。前者穿透能力強，處理效果可靠，后者適于較小物品的滅菌。消毒時由輻照中心專業人員操作。
四.細胞培養用液的配制與除菌
動物細胞培養常用液有平衡鹽溶液、培養基(天然和合成)及消化液等。配制這些常用液有嚴格的要求：
·使用高純化的三蒸水。
·按照用液的配方計算所需各成分的用量，然后準確量取，并按規定順序溶于三蒸水中。
·保證各組分完全溶解。
·進行pH值測試和調整。
·消毒分裝小瓶，抽樣做無菌實驗，保證用液無菌。
體外培養的細胞對水的質量十分敏感，普通自來水含有大量離子和雜質，對細胞生長不利，甚至會引起細胞死亡。因此，培養細胞所用的水必須高度純化。目前純化水有離子交換水和蒸餾水，前者由于仍帶有非離子物質和有機物質，不適合組織培養使用。細胞組織培養必須使用三蒸水。經金屬蒸餾器制備的蒸餾水又常混有金屬離子，故還需經雙重純水蒸餾器(玻璃)蒸餾。本實驗室組織培養用水制備過程是：自來水→離子交換水→玻璃雙重純水蒸餾器蒸餾兩次。新鮮三蒸水應貯存于棕色磨口試劑瓶中，避免光對蒸餾水的作用。在使用過程中，應盡量減少瓶口開放次數，減少污染機會。蒸餾水存放時間不要超過兩周，最好現制現用。
(2)平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)的配制
BSS是在Rringer生理鹽水基礎上發展起來的。它是人工合成培養基的基礎用液，又常用來洗滌組織細胞。其主要成分是無機鹽和葡萄糖。無機離子是細胞的重要成分，維持細胞滲透壓及其生存環境的穩定；葡萄糖供給細胞生存所需的能量。BSS液中少量酚紅是作為溶液酸堿度變化的指示劑，溶液變酸時呈黃色，溶液弱堿性(pH7．2—7．4)時呈深紅色，pH值升高到7．6以上時為紫紅色。在碳酸鹽緩沖系統中，NaHCO3具有調節CO2濃度的作用。
Hanks液和Earle液是多數培養基的基礎溶液，兩者的主要區別是緩沖能力不同。Hanks液的NaHCO3含量較低(0．35克/升)，其緩沖能力較弱，一般用空氣平衡，即利用空氣中的CO2使溶液pH值平衡。
Earle含有高濃度的NaHCO3(2．2克/升)，其緩沖能力較強，溶液pH值需在5％的CO2培養箱中才能達到平衡。
1.BSS液的配制方法(以Hanks液為例)
甲液：Na2HPO4·2H2O 0．06克
KH2PO4 0．06克
MgSO4·7H2O 0．20克
葡萄糖 1．00克
NaCl 8．00克
三蒸水 750毫升
乙液：CaCl2 0．14克
三蒸水 100毫升
①將乙液徐徐加入甲液中。②將0．35克NaHCO3溶解在37℃ 100毫升三蒸水中。③用數滴NaHCO3液溶解0．02克酚紅。④將②、③液移入①液中。⑤用三蒸水定容至1000毫升，充分混勻，4℃冰箱過夜。⑥濾過消毒，小瓶分裝，冷藏。
注意：酚紅對細胞有一定毒性，目前實驗中的用量除0．02克外，還有0．01克和0．005克，也有BSS液中不加酚紅的。酚紅量不同，BSS顏色也不同。
2.配制BSS液的要求
①BSS液中各試劑規格為一級GR試劑或二級AR試劑。
②配制后液體呈桃紅色，pH 7．4左右，沒有混濁和沉淀。
③含鈣離子、鎂離子的物質要單獨溶解。
④可配制10倍濃度的貯存液，濾過消毒，分裝，每瓶10毫升，冰箱保存。使用時每瓶加三蒸水至100毫升。
⑤鈣離子、鎂離子是細胞膜的重要組分，有使細胞凝聚的作用。因此，用于分離細胞的消化液宜用無鈣離子、鎂離子離子的D－Hanks液或PBS液配制。
天然培養基有血清、血漿、水解乳蛋白、膠原和組織提取液。
◇血清
血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人AB血清、兔血清等，其中以胎牛血清質量最好，但來源困難，價格較貴。血清中含有：①多種蛋白質(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白、酶等)和核酸；②多種金屬離子(K＋、Na＋、Mg2＋、Cu2＋、Ca2＋等)；③激素；④促貼附物質，如纖粘蛋白(fibronectin，FN)．、冷析球蛋白(cold insoluble globulin，CIG)等。血清為細胞提供激素；生長因子、轉移蛋白、基膜成分等，但血清成分個體差異大，常影響實驗結果，其來源又受限制。此外，血清也是污染細胞的一個途徑，它還是分離細胞代謝產物的一種障礙。
優質血清透明，呈淡黃色，不溶血或少溶血。血清經56℃30分鐘滅活后，顏色較深。血清滅活后可能丟失某些成分，但滅活血清性質相對穩定，便于使用和保存。細胞培養用的血清必須保證無細菌、支原體、病毒污染。血清總蛋白量在35—45克/升，球蛋白量不高于20克/升。球蛋白含量高，示胎牛或孕牛感染，因此，球蛋白含量越低的血清，其質量越好。
血清滅活處理步驟
①選用與血清瓶同規格的對照瓶一個。
②對照瓶內放入與血清等體積的水。
③溫度預試：對照瓶內插入2—3支經挑選的溫度計(保證測試溫度的準確性)，放入水浴箱中，接通電源，調節溫度控制鈕，使溫度計所示溫度保持在56℃。
④血清滅活：血清瓶與帶溫度計的對照瓶一齊放入水浴箱中，待溫度計所示溫度上升至56℃時，定時30分鐘。
⑤大瓶血清滅活后，進行分裝。
⑥分裝后，抽樣做無菌試驗，－20～－70℃保存。
使用血清注意事項
①實驗者買到冰凍血清時，首先要觀察血清融化后的顏色和清亮度，若顏色偏紅，或色淺，或出現沉淀，表示血清質差或變質，應當退貨。
②血清凍融后的最上層無色透明，活力最差，分裝前應將其搖勻。
③血清反復凍融使用，其效價下降又容易污染。
④長時間凍存的血清，一旦凍融后出現沉淀物(此物抑制細胞生長)，應棄去。
⑤若有條件，先購買少量幾種批號血清，進行細胞生長曲線、細胞克隆率檢查，從而篩選出質量好的血清。
⑥為了使整個試驗結果穩定，以便前后比較，應使用同一批號血清。