細胞培養的步驟

細胞培養的步驟：

1、細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37℃預熱的DMEM完全培養基中（其中胎牛血清約為10%），輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

加入DMEM完全培養基清洗，棄上清液。加入DMEM完全培養基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養皿/瓶中，在含5% CO2的細胞培養箱中培養。

2、細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%（過早產量不足，過晚細胞狀態不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養的一段時間，非細胞有絲分裂次數）時，去掉完全培養基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度）進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。

加入適量DMEM完全培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM完全培養基清洗，棄上清液。

加入DMEM完全培養基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進行計數，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。

3、細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時，去掉完全培養基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化，放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM完全培養基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM完全培養基清洗，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞），放入凍存管內（管內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內過夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。