五 .RPMI1640 的制備與消毒：
1. 溶解、調 PH 值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積 2/3 的雙蒸水中 , 并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3 次 ( 沖洗液一并加入培養基中 ), 充分攪拌至粉劑全部溶解 , 并按照包裝說明添加一定的藥品 . 然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為 100 單位 /ml 。然后用一個當量的鹽酸和 NaOH 調 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ，搖勻。
2. 安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3. 抽濾：配制好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。
4. 分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于 4℃ 冰箱內待用。
5. 使用前要向 100ml 培養液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 時兩周有效）。
六．血清：
１.血清的滅火：細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在 56℃ 水浴中滅火 30 分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。
1. 血清必須貯存于–20 ～ -70 ℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可
將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 %，必須預留此膨脹
體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。
2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清 入
培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室 溫下全
溶后再分裝，一般 50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規則搖 晃均勻(小心勿
造成氣泡 ，使溫度與成分均一，減少沈淀的發生。勿直接由－２０ ℃ 直接 至３７ ℃ 解凍，因溫度
改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。
4. heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均 勻。此
熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般 議作此熱處理，
因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應
有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and
platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell
type。
５.勿將血清置于３７ ℃太久，若在３７ ℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較 不穩定
之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后
血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本 身之品質。若欲減少這
些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上 清液可以加入培養基中一起過濾。
不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀
物在顯微鏡下觀察像是 小黑點 ，常會誤認為血清遭受污染，而將血清 放在３７ ℃中欲培養此 微
生物“，但在37 ℃ 環境下，又會使此沈淀物增多，更 會誤認為微生物之增殖，但以培養細菌之
培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品
應立即停用，更換另一批號的血清。
七 .HEPES 溶液：
HEPES 的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的 pH 范圍。使用終濃 度為 10-50mmol/L ，一般培養液內含 20mmol/LHEPES 即可達到緩沖能力。
1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：
準確稱取 HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容至 1L 。過濾除菌，分裝后 4℃ 保存。
注意：因為現在市售 HEPES 為約 10g 包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內 HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過濾除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培養液中，或者每 100ml 培養液中加入 2ml 即可。
八 . 谷氨酰胺：
合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故應單獨配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在 4℃ 冰箱中儲存 2 周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養液中谷氨酰胺的含量為 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶， -20℃ 保存，使用時可向 100ml 培養液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。