細胞培養試劑、冷凍和復蘇（一）

細胞培養基

市場上可提供干粉培養基和液體培養基：

       干粉培養基需使用者自己配制并滅菌，其優點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質量不易控制；

       液體培養基是由專業廠家按標準規模化生產，不僅質量得到保證，而且使用十分方便

常用的培養基種類：

       RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys 5A、 M199、F10等

1000 ml RPMI 1640培養基

RPMI 1640 干粉培養基10.4g（1包）

蒸餾水 400ml

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磁力攪拌至完全溶解 

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加三蒸餾水定容至1000ml

       在超凈臺內無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200 ml/瓶，-20℃保存備用。

       用前取一瓶溶解，每200 ml培養液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100 U/ml。

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細胞培養液

血清

熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清

熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細胞因子和免疫相關的實驗，建議血清不要滅活。因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，還會影響血清的質量。滅活后嚴重影響細胞生長速度，且細胞貼壁率降低。

血清中的沉淀物：

— 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心3000 rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理

— 顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清

平衡鹽液體

       組織細胞培養中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調節pH值、供給細胞生存所需的能量和無機離子成分，用于洗滌組織、細胞等

PBS（Phosphate-Buffered Sallines）：

    KCl                       0.20g             KH₂PO₄                 0.20g

      NaCl                     8.00g             Na₂HPO₄?7H₂O      2.16g

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）標準型

CaCl₂(無水氯化鈣)       0.10g      KCl                     0.20g

KH₂PO₄                 0.20g             MgC_l2·6H2O        0.10g

NaCl                    8.00g             Na₂HPO₄·7H₂O      2.16g

D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)

KCl                0.40g      KH₂PO₄          0.06g

NaCl              8.00g      NaCO3        0.35g

Na2HPO4       0.048g    D-Glucose      1.00g      Phenol Red     0.01g

消化液：分離組織和分散細胞

—    常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液

—    單獨或混合使用

胰蛋白酶溶液

—    主要作用：使細胞間的蛋白質水解，使細胞相互離散

—    消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養液，能終止消化作用

       —    胰蛋白酶溶液配制

              1、稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調成糊狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩

              2、次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -20℃保存備用（以免分解失效），常用濃度為0.25% （0.1%-0.5%）

              3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調pH 至7.2 左右