6、血清的有關問題:
新生牛血清:新出生牛5天內取血制成
小牛血清:小牛出生16周以內采血制成。
胎牛血清:(進口血清)要求剖腹取胎制成。
國內廠家往往不能做到,經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。
根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為:
(1)特級胎牛血清:40納米過濾,內毒素含量≤10EU,
血紅蛋白含量≤10mg/dl。
(2)優等胎牛血清:經過3次100納米過濾,
內毒素含量≤25EU/ml,
血紅蛋白含量≤25mg/ml。
(3)標準胎牛血清:3次100納米過濾,低內毒素,低血紅蛋白含量。
(4)活性碳/葡聚糖處理血清:激素含量大大降低。
(5)透析型胎牛血清:次黃嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。
7、培養基在使用過程中應注意的問題:
(1)培養基在使用前需37℃預熱或在室溫平衡后再使用。
(2)細胞培養過程中,吸取過培養液的吸管不能再用火焰燒灼,防止殘留在吸管內的培養基焦化,將有害物質帶入培養液中。
(3)盡量縮短各種液體、細胞的暴露時間。
(4)避免液體間、細胞間的交叉污染。
(5)配制完全培養基時,配制的量最好在2周內用完為好。
8、其他細胞培養用液:除培養基、血清、谷氨酰胺外,其他幾種液體也屬必須,不可省略。
(1)雙抗:200倍,(1ml/支)其終濃度為青霉素100U/ml;鏈霉素100ug/ml,-24℃保存。
(2)L-谷氨酰胺:100倍,(1ml/支), 終濃度2mM,-24℃保存。
(3)丙酮酸鈉:配制濃度50mM,4ml/支,終濃度為1mM/ml,-24 ℃保存。
(4)Hepes液:配制濃度1M(5ml/支),一支Hepes加入到200ml完全培養基中,終濃度為25mM/ml,常溫保存。
9、支原體污染及檢測:
(1)支原體污染在細胞培養中最常見、不易被查覺,但支原體污染可顯著影響細胞功能干擾實驗結果。支原體是介于細菌和病毒之間的目前所知能獨立生活的最小微生物,它無細胞壁,形態呈高度多形性,最小直徑0.2um,可通過濾器。
目前中心通過對國內100余株/系細胞的檢測,形勢不容樂觀。污染率達30%~60%
。課題組從國外引進細胞株/系也經常出現支原體的污染。支原體在污染細胞后,它通過影響細胞的DNA、RNA
的合成及急速消耗培養基中的氨基酸來抑制細胞的生長,并能降低細胞的融合率。因此,在運用各種細胞系進行實驗研究時,首先要證明所用細胞有無支原體的污染。
(2)支原體污染后,培養基可不發生渾濁,細胞病變輕微或不明顯,因此難以發現。目前,支原體檢測的方法有以下幾種。
(a)相差顯微鏡觀察;
(b).低張處理地衣紅染色法;
(c)熒光染色法;
(d).酶標法;
(e)PCR法:基礎醫學細胞中心使用該方法進行檢測。
優點:靈敏度高,檢測耗時短,樣品量小(只需50ul細胞培養用液上清)。
缺點:引物及制劑費用較高。