細胞總蛋白質的分離提取

細胞器是一種動態的結構，如內質網、細胞核和高爾基體等，其蛋白質組成除了駐留蛋白質之外，還包括穿梭蛋白質和瞬間相互作用的蛋白質。對于這些組成成分的研究，即亞細胞蛋白質組研究將有助于對這些蛋白質做全面的挖掘，從而對細胞器的功能作深入的闡述。蛋白質提取與制備具體操作方法如下：

一、材料的選擇

早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質豐富的器官從中提取蛋白質。

但目前經常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細胞膜或內膜等原材料，因而對提取要求更復雜一些。原料的選擇主要依據實驗目的定。一般要注意種屬的關系，事前調查制備的難易情況。

二、蛋白質的分離

（一）細胞的破碎

細胞的破碎材料選定通常要進行處理。要剔除結締組織及脂肪組織。如不能立即進行實驗，則應冷凍保存。除了提取細胞外成分，對細胞內及多細胞生物組織中的蛋白質的分離提取均須先將細胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預先絞碎再制成勻槳。

1. 機械方法 主要通過機械切力的作用使組織細胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機（轉速可達10000rpm，具高速轉動的鋒利的刀片），宜用于動物內臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個磨砂面相互摩擦，將細胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質塑料等。小量的也可用乳缽與適當的緩沖劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細。但在磨細時局部往往生熱導致變性或pH 顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時。此外，磨細劑的吸附也可導致損失。

2. 物理方法 主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。①反復凍融法：于冷藏庫或干冰反復于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結變性；②冷熱變替法：將材料投入沸水中，于90℃左右維持數min，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞；③超聲波法：暴露于9～10 千兆聲波或10～500 千兆超聲波所產生的機械振動，只要有設備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應用超聲波處理時應注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重；④加壓破碎法：加一定氣壓或水壓也可使細胞破碎。

3. 化學及生物化學方法 這類方法包括①有機溶媒法：粉碎后的新鮮材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性；②自溶法：將待破碎的鮮材料在一定pH 和適當的溫度下，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩定，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。于溫室30℃左右較早溶化。自體融解過程中pH 顯著變化，隨時要調節pH。自溶溫度選在0～4℃，因自溶時間較長，不易控制，所以制備活性蛋白質時較少用；③酶法：與前述的自溶法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。但值得提出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g菌體加1～10mg 溶菌酶， pH6.2～7.0 1h 內完全溶菌。于生理食鹽水或0.2mol 蔗糖溶液中溶菌，雖失去細胞膜，但原形質沒有脫出。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶及去氧膽酸鈉等。此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細胞脹破。

（二）細胞器蛋白的分離

制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。各類生物大分子在細胞內的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細胞核內。RNA 則大部分分布于細胞質。各種酶在細胞內分布也有一定位置。因此制備細胞器上的生物大分子時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布有所了解。

細胞經過破碎后，在適當介質中進行差速離心。利用細胞各組分質量大小不同，沉降于離心管內不同區域，分離后即得所需組分。細胞器的分離制備、介質的選擇十分重要。最早使用的介質是生理鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發生聚集作用結成塊狀，沉淀分離效果不理想，現一般改用蔗糖、Ficoll（一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提取：大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩定性好、溶度大，也是提取蛋白質的最常用溶劑。