細胞核與線粒體的分級分離

一、所需試劑及設備

小白鼠、冰塊、玻璃勻漿器、普通離心機、臺式高速離心機、普通天平、光學顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刻度離心管、高速離心管、滴管、10ml量筒、25m1燒杯、玻璃漏斗、解剖剪、鑷子、吸水紙、紗布、蠟盤、平皿、牙簽。0.25moL/L蔗糖一0.003mol/L CaCl2溶液、1%甲苯胺蘭染液、0.02%詹納斯綠B染液、0.9%NaCl溶液。

附:溶液的配制：
1/300詹納斯綠染液：
取詹納斯綠1克，加Riger氏液300ml。現用現配。
1/3000中性紅染液：
稱取中性紅 (Neutral red)O.1g，加蒸餾水300ml。室溫保存.
Ringer Solution：
NaCl 0.9g
KCl 0.042g
CaCl2 0.025g
蒸餾水 100m1
0.25mol/L蔗糖一0.003mom/L氯化鈣溶液：
蔗糖 85.5g
CaCl2 0.33g
蒸餾水 1000ml

二、操作步驟

（一）制備肝細胞勻漿
將小白鼠用頸椎脫位法處死，迅速開腹取肝，剪成小塊(去除結締組織)盡快置于盛有0.9%NaCl的燒杯中，反復洗滌，除去血污，用濾紙吸去表面的液體。
稱取1g肝組織(濕重)放在小平皿中，用量筒量取8ml預冷的0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L CaCl2溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全加入。剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉動研磨3一5次，用8層紗布 (先用蔗糖液濕潤)過濾勻漿于離心管中，然后制備涂片①，做好標記，自然干燥。

（二）分級分離與觀察
1. 細胞核的分離提取與觀察
將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機，以2500rpm，離心15min；緩緩取上清液，移入高速離心管中，放在冰塊中，待分離線粒體用；同時涂一張上清液片②，做好標記，自然干燥；余下的沉淀物進行下一步驟。
用6m1蔗糖一氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以250Orpm離心15min棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載片上，即涂片③，自然干燥。
將涂片①②③用1%甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。
2. 線粒體的分離提取與觀察
將上述裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20min，棄上清，留取沉淀物。加入0.25moL/L蔗糖—0.003mol/L氯化鈣溶液1m1，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20min，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入蔗糖一氯化鈣溶液0.1ml混勻成懸液(可用牙簽)。取上清液和沉淀懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上(分別標記④⑤涂片)，各滴一滴0.02%詹納斯綠B染液蓋上蓋片染色20min。
油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍綠色。