(三)核移植
1. 顯微注射器的準備:
每次手術前應向顯微注射器的整個管道系統灌入手術液或雙蒸水,檢查管道的各銜接處有否漏氣。管內只要有一極小的氣泡,注射器的調節就失靈。同時應注意選擇彈簧上彈性較靈敏的部位以便操作準確(圖17.2,17.3,17.4)。
2. 微型吸管的制備:
吸管最好用軟質玻璃管。制作前,先將玻管用洗液洗凈,再用蒸餾水徹底將酸洗去。這樣可使拉出的微吸管內部潔凈,不致影響細胞核的吸入和射出。將玻管拉成口徑1mm的細管,然后在微火焰上,再拉成微吸管,管徑在10-20微米之間(圖17.5,17.6)。
3. 吸細胞核:
吸核的方法不是將微吸管頭刺入供體細胞內吸取細胞核,而是利用顯微操縱臺通過輕輕地來回轉動千分尺外徑,將一個細胞慢慢地吸入微吸管。必須注意微吸管的內徑要比細胞小,這樣能使被吸入的細胞由于吸力的作用而破裂,結果可以依靠目測,將細胞核和包在它周圍的一部分細胞質一起吸入管內,避免細胞核直接與液體接觸,以免受損。還應調節使供體細胞盡量靠近管口,避免注核時帶入較多的手術液。
4. 注核:
將吸有供體細胞核的微吸管在離動物極45度左右的地方刺入動物半球的中心,再稍微向上提一下管口,然后輕輕地推動微量注射器,把管內的細胞核連同周圍的細胞質慢慢地注入卵內。如果注射速度太快,注入卵內的壓力過大,則會使卵子破裂,導致實驗失敗。
一般從首次去膠膜到注完15個左右的核,需2-2.5小時,時間過長,將會影響移核卵的發育。
5. 培養觀察:
移核后的卵子轉入1/10 Holtfreter 液中,置25℃恒溫箱中培養。及時觀察卵子的發育并做好記錄。
6. 用同批卵按常規人工授精的方法獲得受精卵,置培養皿中在同等溫度條件下培養,以便與移核卵作對比觀察。
二、哺乳動物的細胞核移植
1. 取卵:
取卵的方法與實驗十六相同。
2. 去核卵的制作:
用白色小鼠的受精卵作受體,在有相差干涉裝置的顯微鏡下,將預先備好的移核針管頭端,借助顯微操作器刺入受精卵的透明帶,讓針頭僅穿過透明帶而不刺破卵子的質膜。再用針口對準雄核,隔著質膜將其吸入針管內。然后將針口對準雌核,以同樣的方法將雌、雄原核吸至針管前端,隨即慢慢拔出針管。此時可見到卵子質膜彈性很大,在管口與透明帶之間質膜被拉成細絲,然后斷開,形成只有細胞質的去核卵和在針管內有兩個原核和少量細胞質,外有質膜包裹的兩個部分。該去核卵即作受體用(圖17.7)。
3. 細胞核移植:
用同法將作供體的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入針管內,然后吸入少許仙臺病毒(Inactivatied Sendai
Viras),再將上述針管移至去核卵,讓管口穿過透明帶原有的小孔進入卵周隙,此時輕輕轉動注射器,使外有質膜包裹的雌、雄原核和仙臺病毒一起進入受體卵的透明帶與質膜之間的卵周隙,然后把針管緩緩抽出即可(圖17.8)。如繼續觀察,能見到在病毒的作用下,移入細胞核所帶的質膜與去核的質膜接觸處,質膜慢慢溶化消失,雌、雄原核進入受體卵的融合過程。該移核卵子,實際是核質雜交。如果操作成功,在二氧化碳培養箱內培養,
90%以上的卵子可發育至胚泡期,經過胚胎移
植可獲得核移植的核質雜交小鼠。
在核移植的全過程中,每一步驟均需嚴格操作,盡量減少對細胞膜、質和核的損傷,所用的器皿也需嚴格消毒,防止污染,以提高各個步驟的成活率。
實驗材料
1.實驗材料:
蛙受精卵,蛙囊胚晚期或原腸早期胚胎,昆明白小鼠,黑小鼠(C57BL―6).
2.實驗儀器:
顯微操作器、顯微注射器、拉針器、酒精噴燈、虹膜剪刀、尖頭鐘表鑷、
內徑0.5cm,0.3cm玻璃管、1mm玻璃毛細管、玻璃針、培養皿、彎頭吸管、毛細吸管、微吸管、溫箱、雙目解剖鏡、顯微鏡。
3.實驗藥品:
手術液:即 Holtfreter液,需煮沸消毒
分離液:
NaCl 0.35g
KCl 0.005g
雙蒸水 100ml
待以上混合液煮沸消毒冷卻后加入
EDTA(乙二胺四乙酸)18.6mg
NaHCO3 0.02g
Ringer液
70%酒精
2%瓊脂