細胞爬片的免疫組化染色鑒定

實驗概要

本實驗介紹了細胞爬片的免疫組化染色鑒定操作流程及注意事項。

主要試劑

PBS，0.5%Triton X-100(DPBS配)，3%H₂O₂，封閉血清 (5%正常二抗血清DPBS液)，一抗(PBS配，滴度1：200，濕盒)，二抗工作液(濕盒)，C液(濕盒)，DAB顯色液，蘇木素，樹膠

主要設備

20mm蓋玻片，90mm培養皿，電子顯微鏡

實驗步驟

1. 將已消毒的20mm蓋玻片置于90mm培養皿中，按2×10⁴/ml的細胞密度將細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，5天后進行免疫細胞組織化學染色鑒定。
2. PBS清洗標本 3次各 1 min。
3. 冰丙酮固定 15 min。
4. 空氣干燥 5min。
5. PBS清洗標本 3次各 2 min。
6. 0.5%Triton X-100(DPBS配) 孵育 1次 20 min。
7. PBS清洗標本 3次各 2 min。
8. 3%H₂O₂孵育 15 min。
9. DPBS清洗標本 3次各 2 min。
10. 封閉血清孵育(5%正常二抗血清DPBS液)20min。
11. 一抗孵育(PBS配，滴度1：200，濕盒)4℃過夜或37℃ 60 min。陰性對照最好用一抗來源血清，否則用PBS液
12. PBS清洗標本 3次各 5 min。
13. 二抗工作液孵育(濕盒) 37℃，30 min。
14. PBS清洗標本 3次各 5 min。
15. C液(濕盒) 37℃，30 min。
16. PBS清洗標本 3次各 5 min。
17. DAB顯色(避光，鏡下觀察至棕色)約3~10min。
18. 蒸餾水洗 2次 1 min。
19. 蘇木素復染 0.5~1min。
20. 自來水洗 30min。
21. 樹膠封片。

注意事項

1. 良好的細胞爬片是進行免疫組織細胞的基礎，要獲得良好細胞爬片須注意：
   1) 對于粘附分子較少的細胞爬片時間要達5天以上，這樣細胞爬片才較牢固，沖洗時不易脫片；
   2) 接種的細胞密度適中，以2×10⁴/ml為宜，若細胞密度太高，5天后細胞連接成片沖洗時易脫片；
2. 冰丙酮固定后玻片可密閉保存于4℃冰箱，冰丙酮固定時會使細胞收縮，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3. 沖洗時只須輕輕振蕩培養皿，(不可用吸管太用力吹，易脫片)。
4. 加一抗、二抗后沖洗時第一次須將玻片傾斜。
5. Triton X-100表面活性劑，脫去細胞膜中最主要的成分脂質，對于抗原表達在胞漿或胞核者方使用，對于抗原表達在胞漿者時間要控制好，使其破壞細胞膜而核膜破壞較少。