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  • 發布時間:2019-03-28 22:41 原文鏈接: 細胞破碎和蛋白質溶解實驗_勻漿法

    為了純化細胞蛋白質,采用有效的方法進行細胞破碎和固液分離是必要的。它是全過程的第一步,通常是將處于細胞不同位置的待純化蛋白釋放出來,溶入已知成分的溶液內。該步驟是目的蛋白初級分離純化階段的重要環節,它直接影響產物的回收率,也可能影響產物的純度。

    實驗方法原理

    通過固體剪切力破碎組織和細胞,釋放蛋白進入溶液。市售的勻漿器主要有四類,刀片式組織破碎勻漿器、內切式組織勻漿器、玻璃勻漿器和用于規模生產的髙壓勻漿器。玻璃勻漿器的勻漿頭(杵)有玻璃制的,也有特夫隆制的,既可以手動也可以電動。由于勻漿過程中蛋白質被蛋白酶降解的可能性較小,所以勻漿是簡便、迅速和風險小的組織破碎方法,是實驗室首先考慮的方法之一。

    實驗材料

    組織

    試劑、試劑盒

    緩沖液

    儀器、耗材

    勻漿器

    實驗步驟

    1. 用組織剪或芋術刀迅速將清洗的組織分離成適宜的小塊,如 1 cm3


    2. 每體積濕重組織通常加 3~5 倍體積預冷的勻漿緩沖液至勻漿容器內;


    3. 制備勻漿 :


    3.1 電力驅動的玻璃勻漿器以 500~1500 r/min 的速度,勻漿 3~6 次,每次 5~10 s 。


    3.2 手動玻璃勻漿器勻漿 10 ~20 次。


    3.3 刀片式組織破碎勻漿器和內切式組織勻漿器以 1000~3000 r/min 的速度,高速勻漿 3 次 ,每次 20~30 s,次間暫停幾秒。

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    注意事項

    1. 玻璃勻漿器杵和臼之間的空隙應為 0.35~0.70 mm。 電動玻璃勻漿器常用于勻槳肝、心、肌肉等軟組織的勻漿;手動玻璃勻漿器常用于培養細胞和腦組織等的勻漿。


    2. 勻漿過程應注意維持低溫。玻璃勻漿器可外置冰水浴,其他勻漿容器可預冷或在冷室內勻漿。


    3. 勻漿時所霈勻漿緩沖液的體積在不同條件下可有很大差別,有時甚至可為濕重組織體積的 9~10 倍。


    4. 勻漿的效果可以用相差顯微鏡觀察組織細胞狀況評估,也可定量單位濕重組織釋放的蛋白質含量監控。

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