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  • 發布時間:2020-07-14 09:38 原文鏈接: 細胞的離心分離基礎和分離實例(七)

    7 鼠肝主質細胞的多倍體級浮選分離 l   設備及樣品:同例(5)  l   轉速1350rpm(~210g)  l   溫度4℃  l   初始充樣流速12ml/min,直至細胞充滿離心室 l   分別用流速19,32,41(ml/min)收集I,II,III 細胞,收集量分別為100ml,150ml 及100ml  l   已收集細胞儲存于4℃  l   停止輸液后轉頭停轉,從離心室收集沉淀并收集混合室樣品 l   用低速低溫離心機甩平轉頭分別將收集液離心沉淀,1000×g,10 分鐘,將沉淀與3ml 浮選介質混合制成倍體細胞懸液,4℃保存。 l   結果:細胞數量與活性分析

    成分流量ml/min細胞數量×106活性(%)組成
    原液
    137.8842n,4n,8n,16n 及少量細胞聚集團及細胞碎片
    I1939.8722n,4n, 少量細胞碎片
    II3254.7854n(90%)
    III4115.5834n,8n,細胞聚集團
    沉淀
    17.182同原液數據
    混合室
    5.285同原液數據
    總數
    127.0(92%)

      8 肝的Kupffer (星形細胞)及endothelial( 內皮)細胞純化 l   浮選設備:同上述例  l   浮選用介質:GBSS  l   各種染色介質(參考各節)  l   肝竇狀細胞(Sinusoidal)懸液 l   分離步驟

    i.用不連續Nycodenz 梯度制備鼠肝Sinusoidal 細胞懸液(參見本文前例)
    ii.安裝離心浮選系統(Hitachi 或Beckman)
    iii.標準離心室:3,250rpm,4℃
    iv.初始流量13.5ml/min 注入1~5×108個細胞懸液
    v.在流量分別為18,32,48ml/min 時分別收集100ml,150ml,150ml

    收集液中含有白細胞(L)、星形細胞(K)、內皮細胞(E)及主質細胞(P),收集

    液保存在4℃。
    vi.離心后收集在浮選室中的細胞
    vii.各種收集液離心沉淀:450g×10 分,沉淀分別混懸于3mlGBSS 中

      viii. 結果如下表:

    成份細胞主要類型細胞總量×106活性染色細胞比例%組成%






    P1E1PLEK
    初始細胞液Sinusoidal167.48724.786.80.613.261.524.7
    I 收集液(100ml)L19.9803.028.6/71.425.63
    II 收集液(150ml)E82.5959.089.2/10.880.29
    III 收集液(150ml)K34.79783.595.1/4.911.683.5
    沉淀細胞聚集團9.89534.59616.04.044.635.4

      注: l  表成染色比例中 P1:Peroxidase 過氧化物,E1:Esterrase(酯酶) l   Sinusoidal 細胞制備方法參見前述內容。 9 鼠肝儲脂細胞的離心浮選純化(文獻14

    i.離心浮選設備(同上)
    ii.轉速3,250rpm,4℃,流量16ml/min
    iii.Sinusoidal 細胞制備參照前述二階不連續梯度離心法。
    iv.加樣:5~50×107 個細胞注入混合室
    v.用16ml/min 及18ml/min 分別收集二次,最后收集在離心室中剩下的細胞液
    vi.以上三種收集液分別450g×10 分鐘離心,收集沉淀后分別用2mlGBSS 混成

    懸液

      


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