例7 鼠肝主質細胞的多倍體級浮選分離 l 設備及樣品:同例(5) l 轉速1350rpm(~210g) l 溫度4℃ l 初始充樣流速12ml/min,直至細胞充滿離心室 l 分別用流速19,32,41(ml/min)收集I,II,III 細胞,收集量分別為100ml,150ml 及100ml l 已收集細胞儲存于4℃ l 停止輸液后轉頭停轉,從離心室收集沉淀并收集混合室樣品 l 用低速低溫離心機甩平轉頭分別將收集液離心沉淀,1000×g,10 分鐘,將沉淀與3ml 浮選介質混合制成倍體細胞懸液,4℃保存。 l 結果:細胞數量與活性分析
| 成分 | 流量ml/min | 細胞數量×106 | 活性(%) | 組成 |
| 原液 | 137.8 | 84 | 2n,4n,8n,16n 及少量細胞聚集團及細胞碎片 | |
| I | 19 | 39.8 | 72 | 2n,4n, 少量細胞碎片 |
| II | 32 | 54.7 | 85 | 4n(90%) |
| III | 41 | 15.5 | 83 | 4n,8n,細胞聚集團 |
| 沉淀 | 17.1 | 82 | 同原液數據 | |
| 混合室 | 5.2 | 85 | 同原液數據 | |
| 總數 | 127.0(92%) |
例8 肝的Kupffer (星形細胞)及endothelial( 內皮)細胞純化 l 浮選設備:同上述例 l 浮選用介質:GBSS l 各種染色介質(參考各節) l 肝竇狀細胞(Sinusoidal)懸液 l 分離步驟
| i. | 用不連續Nycodenz 梯度制備鼠肝Sinusoidal 細胞懸液(參見本文前例) |
| ii. | 安裝離心浮選系統(Hitachi 或Beckman) |
| iii. | 標準離心室:3,250rpm,4℃ |
| iv. | 初始流量13.5ml/min 注入1~5×108個細胞懸液 |
| v. | 在流量分別為18,32,48ml/min 時分別收集100ml,150ml,150ml |
| 收集液中含有白細胞(L)、星形細胞(K)、內皮細胞(E)及主質細胞(P),收集 | |
| 液保存在4℃。 | |
| vi. | 離心后收集在浮選室中的細胞 |
| vii. | 各種收集液離心沉淀:450g×10 分,沉淀分別混懸于3mlGBSS 中 |
viii. 結果如下表:
| 成份 | 細胞主要類型 | 細胞總量×106 | 活性 | 染色細胞比例% | 組成% | ||||
| % | P1 | E1 | P | L | E | K | |||
| 初始細胞液 | Sinusoidal | 167.4 | 87 | 24.7 | 86.8 | 0.6 | 13.2 | 61.5 | 24.7 |
| I 收集液(100ml) | L | 19.9 | 80 | 3.0 | 28.6 | / | 71.4 | 25.6 | 3 |
| II 收集液(150ml) | E | 82.5 | 95 | 9.0 | 89.2 | / | 10.8 | 80.2 | 9 |
| III 收集液(150ml) | K | 34.7 | 97 | 83.5 | 95.1 | / | 4.9 | 11.6 | 83.5 |
| 沉淀 | 細胞聚集團 | 9.8 | 95 | 34.5 | 96 | 16.0 | 4.0 | 44.6 | 35.4 |
注: l 表成染色比例中 P1:Peroxidase 過氧化物,E1:Esterrase(酯酶) l Sinusoidal 細胞制備方法參見前述內容。 例9 鼠肝儲脂細胞的離心浮選純化(文獻14)
| i. | 離心浮選設備(同上) |
| ii. | 轉速3,250rpm,4℃,流量16ml/min |
| iii. | Sinusoidal 細胞制備參照前述二階不連續梯度離心法。 |
| iv. | 加樣:5~50×107 個細胞注入混合室 |
| v. | 用16ml/min 及18ml/min 分別收集二次,最后收集在離心室中剩下的細胞液 |
| vi. | 以上三種收集液分別450g×10 分鐘離心,收集沉淀后分別用2mlGBSS 混成 |
| 懸液 |
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