細胞、細胞器及組分的分離與觀察2

細胞器標記酶的測定是評價細胞器內膜組分和分離純度的主要依據,如線粒體內膜上分布有細胞色素氧化酶,該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態呈現藍綠色,從而使線粒體顯色,而胞質中的染料被還原成無色。

詹納斯綠B是一種活體染料,能對動植物的細胞或組織在活體狀態下進行無毒害的染色。由于染料（堿性染料）的膠粒表面帶有陽離子,酸性染料的膠粒表面帶有陰離子,而被染部分本身具有陽離子或陰離子,這樣,它們彼此之間發生吸引作用,染料就被堆積下來。染色法可以顯示出活細胞內的某種天然結構存在的真實性,而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以引致細胞的死亡。

Gimesa是一種復合染料,即為酸性染料與堿性染料的結合物。在水溶液中電離為帶正電和負電的染料離子。

三、實驗用品

材料： 鼠肝臟,豬肝臟

試劑：

(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4)

0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液10ml

0.1mol/L鹽酸8.4ml

加雙蒸水到100ml,再加蔗糖使濃度為0.2mol/L

(2)0.34mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液（pH7.4）,配法同上。

(3)1%詹納斯綠B(Janus green B)染液,稱取50mg（pH7.4）,詹納斯綠B溶于5ml生理鹽水中,稍微加熱使之溶解后,過濾,即為1%原液。

(4)姬姆薩染液（Giemsa）：稱取姬姆薩粉0.5g,甘油33 ml 、純甲醇33ml。先在姬姆薩粉中添加少量甘油,然后在研缽內研磨至無顆粒狀,再將剩余甘油倒入混勻,56℃左右保溫2h使其充分溶解,最后加甲醇混勻, 成為姬姆薩原液,保存于棕色瓶。使用時吸出少量,用1/5mol/L磷酸緩沖液作10-20倍稀釋。

(5)1/15 mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）：1/15 mol/ L磷酸二氫鉀50 ml,1/15 mol/ L磷酸氫二鈉50 ml

(6)卡諾（Cornay）固定液：無水乙醇6 ml冰醋酸1 ml氯仿3 ml

(7)生理鹽水

儀器：解剖刀,剪刀,漏斗,玻璃勻漿器,尼龍織物,刻度離心管,顯微鏡,冷凍高速離心機。

四、實驗步驟

1. 制備肝細胞勻漿：實驗前將鼠空腹12小時,擊頭處死,剖腹取肝,迅速用生理鹽水洗凈血水,用濾紙吸干水,稱取肝組織1 g,剪碎；用預冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗滌數次。然后按每克肝加9 ml預冷的0.25mol/L蔗糖溶液的量,分數次添加蔗糖溶液,在0℃-4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿,肝勻漿用雙層紗布過濾(濾液制一張涂片 ①,自然干燥)。

2.差速離心：將0.34 mol/ L 蔗糖溶液4.5 ml放入離心管,然后沿管壁小心地加入4.5 ml鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差速離心。

3.分離物鑒定：

（1）細胞核：將干燥后的三張涂片加入Carnoy固定液15min,晾干。Giemsa染液染10min,蒸餾水漂洗數秒,用濾紙吸干水,用顯微鏡（40×）檢查,細胞核呈紫紅色,混雜的細胞質為淺藍色碎片。

（2）線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上,勿太密。滴加 1%詹納斯綠溶液染色,10分鐘后用光學顯微鏡觀察,線粒體呈藍綠色,小棒狀或啞鈴狀。

(涂片過程）

注意事項：

1.試驗全過程要在0～4℃進行,如果使用非冷凍控溫的離心機一般只宜分離細胞核和線粒體,同時注意使樣品保持冷凍；盡可能充分破碎組織,縮短勻漿時間。整個分離過程不宜過長。