細胞自噬研究策略

醫學科研實驗基礎知識筆記（四）：細胞自噬研究策略

細胞自噬是指細胞在外界環境因素的影響下， 細胞利用溶酶體降解自身受損、 變性或衰老的大分子物質以及細胞器的自我消化過程。自噬是細胞的一種自我保護機制， 廣泛存在于真核細胞內， 在調節細胞生存和死亡的過程中， 起著重要的作用。

當細胞發生自噬后， 在自噬相關基因的調節下， 細胞通過單層或雙層膜， 包裹待降解的細胞質或細胞器， 形成囊泡狀的自噬體（autophagosome） 。然后自噬體再和溶酶體（lysosome）

發生融合形成自噬溶酶體（autolysosome） ， 由溶酶體內的一系列水解酶， 降解自噬溶酶體內所包裹的內容物， 以實現細胞對自身代謝和能量的更新。

1.自噬的細胞學分類及過程

根據細胞內物質運輸到溶酶體的方式以及生理功能的差異， 哺乳動物的細胞自噬可以分為三種類型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。

1） 大自噬/宏自噬：我們通常所說的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的過程中， 細胞質中可溶性的大分子物質以及變性的細胞器， 被內質網、 線粒體來源的單層或雙層膜包裹形成自噬體。接著自噬體的外膜與溶酶體膜融合， 進一步形成自噬溶酶體， 自噬體內的待降解物被一系列的水解酶降解， 最終完成整個的自噬過程。

2） 小自噬/微自噬：與大自噬過程不同， 是溶酶體膜自身發生內陷， 包裹和吞噬細胞內待降解的底物， 并在溶酶體內發生降解。小自噬與大自噬的區別就在于， 在小自噬過程中胞質成份是直接被溶酶體包裹， 沒有形成自噬體的過程。

3） 分子伴侶介導的自噬：在分子伴侶介導發生的自噬過程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白質分子。分子伴侶蛋白識別帶有特定氨基酸序列的底物蛋白質分子， 并與之結合， 然后再經溶酶體膜上的受體 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 轉運到溶酶體；底物蛋白分子再在溶酶體內， 被水解酶降解。因此， 分子伴侶介導的自噬與前兩者不同， 在降解蛋白時具有選擇性。而大自噬和小自噬現象中， 一般而言， 在降解蛋白時沒有明顯的選擇性。

2.自噬信號通路

3.自噬與凋亡的關系

細胞凋亡也被稱為 I 型程序性細胞死亡；自噬則被稱為 II 型程序性細胞死亡。凋亡和自噬是兩種顯著不同的細胞死亡形式， 兩者在形態、 生化指標以及調控細胞死亡的過程上都存在著較大的差異， 但兩者又不是兩個完全獨立的過程。許多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情況下也是相互影響和制約的。自噬和凋亡之間存在著三種不同類型的相互作用，而且每種類型都對應著相應的特定的細胞類型、 刺激和環境。

1） 自噬和凋亡互相協同， 共同促進細胞死亡。兩種效應之間， 可以其中一種效應影響另一種效應；自噬也可以作為凋亡的上游調節因子， 直接調控細胞凋亡， 從而影響細胞的死亡；

2） 自噬可以通過促進細胞存活而拮抗細胞的凋亡效應。比如， 可以通過去除因氧化應激受損的細胞器， 或降解變性的大分子物質， 為饑餓的細胞提供生存所需要的營養和能量；或者通過降解未折疊的蛋白來抑制內質網應激。自噬的這些功能將會抑制促凋亡信號的產生， 從而起到拮抗細胞凋亡的作用。

3） 自噬有時雖然自身并沒有導致細胞死亡， 但卻參與了細胞凋亡的過程。比如自噬參與了一些 ATP 依賴的凋亡過程。

4.自噬的分子機制和特征

1） 自噬誘導階段（induction） ：正常生理狀態下， 細胞保持很低的基礎自噬水平。這時細胞內能量充足，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物 1(也就是 mTOR 復合物 1，也叫做 mTORC1)處于活化的狀態。活化的 mTORC1 通過磷酸化的方式使得 ATG13 發生磷酸化反應， 從而抑制細胞的自噬。

2） 成核過程（vesicle nucleation） ：成核過程和 Vps34-ATG6 復合物密切相關。這個復合物還包含有調節性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介導 PAS(也就是前自噬體結構pre-autophagosomal structure)的形成。

Vps34-ATG6 復合體還可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚體以及 LC3， 并通過后兩者促進吞噬泡的伸展擴張。請大家注意， Vps34 在哺乳動物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳動物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 復合體， 也被稱為 PI3K-Beclin-1復合物。

3） 自噬體的延伸階段：這個過程的分子機制是最為復雜的。哺乳動物自噬體的延伸主要依賴于兩個類泛素化的系統：a） ATG12 的結合過程；b） LC3 的修飾過程。

ATG12 的結合過程是類似泛素化的過程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的參與。ATG12 首先由 E1樣酶 ATG7 活化， 再通過 E2 樣酶 ATG10 轉運并結合 ATG5， 然后和 ATG16 結合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多體復合物。這個復合物定位于前自噬體結構的外膜表面， 并參與前自噬體外膜的擴張。

LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修飾過程同樣需要類似泛素活化酶 E1 和 E2 的參與。LC3 前體形成后被 ATG4 加工成胞漿可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 樣酶 ATG7 和 E2樣酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共價連接成為脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并參與膜的延伸。LC3-Ⅱ能夠與新形成的膜結合， 直到自噬溶酶體(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的標識物， 也是一種重要的定位于自噬泡膜上的多信號傳導調節蛋白。

哺乳動物的 ATG12-ATG5 類泛素化過程和 LC3 類泛素化過程并不是獨立運行的， 它們之間可以相互作用、 相互調節。

4） 自噬體的成熟階段：自噬體的成熟主要是指自噬體通過微管骨架在轉運必須內吞體分類復合物(ESCRT)和單體 GTP 酶(Rab S)作用下， 與溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程。參與成熟階段的溶酶體相關蛋白還包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外線抵抗相關腫瘤抑制基因)。

5） 自噬體的裂解階段：是指自噬溶酶體膜的裂解及內容物在溶酶體水解酶的作用下降解的過程。降解過程中產生的氨基酸及部分蛋白可以為細胞提供營養、 能量或循環利用。

5.自噬誘導劑

a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激

b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

c) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

e) Rapamycin：mTOR抑制劑

f) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

6.自噬抑制劑

a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

b) Bafilomycin A1：質子泵抑制劑

c) Hydroxychloroquine（羥氯喹）

除了選用上述工具藥外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。

7.自噬的檢測手段

自噬的評估通常采用多個自噬階段的標志物，因為自噬小體數量的增加可能是自噬上調也可能是自噬最后階段降解被抑制所致，所以設置合適的對照很有必要。

（1）透射電鏡，電鏡觀察自噬體和溶酶體的超微結構；

（2）WB檢測標志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1；生化檢測自噬體膜標志蛋白， 特別是ATG12、 ATG5 和 LC3；熒光顯微鏡檢測 LC3 或GFP-LC3 斑點的形成；生化檢測自噬底物 p62。

（3）WB檢測Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。

（4）組織蛋白酶Cathepsin活力檢測。

（5）IF檢測自噬潮autophagic flux

自噬過程進行觀察和檢測 細胞經誘導或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：

（1）觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

（2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時長，不利于監測（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

（3）利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。

（注意：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。需要多種檢測方法結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。）

（4）檢測長壽蛋白的批量降解：非特異

（5）MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

自噬相關蛋白的定位 在研究自噬相關蛋白時，需對其進行定位。

由于自噬體與溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體關系密切，為了區別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監測自噬體與溶酶體融合。

LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體，轉染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經過固定后還能保留。

Hsp60：定位與線粒體基質，細胞死亡時不會被釋放。

Calreticulin（鈣網織蛋白）：內質網腔

（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理。）

8.自噬研究常規思路

通常情況下，除了研究自噬現象本身，大家更多的是將自噬與各種生命活動或者疾病結合起來，把自噬作為這些方向的一個機制來研究。比如研究自噬如何參與腫瘤的發生發展、如何參與腫瘤的耐藥性與復發轉移、如何參與腫瘤免疫治療的效果、如何參與炎癥反應、如何參與氧化應激，如何參與自閉癥、阿爾茲海默癥的發生與治療等，通常的研究模式：

（1）證明自噬參與了相關研究表型（電鏡、LC3II/I-WB、LC3亞細胞定位、LC3熒光示蹤監測自噬流等）

（2）證明自噬在表型中起到關鍵作用（通過自噬抑制劑、激動劑進行關聯研究）找到表型與自噬橋梁分子（檢測pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成員）

（3）在基因層面通過gain of/lost of function研究橋梁分子在自噬中的作用。

9.研究自噬的文獻參考

[1]. Emerging Mechanisms in Initiating and Terminating Autophagy. Trends Biochem Sci. 2017 Jan;42(1):28-41.

[2]. Targeting autophagy in cancer. Nat Rev Cancer. 2017 Sep;17(9):528-542.

[3]. Autophagy: controlling cell fate in rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2016 Sep;12(9):517-31.

[4]. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis. Nat Rev Immunol. 2016 Nov;16(11):661-675.

[5]. Autophagy and Neurodegeneration: Pathogenic Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1015-1034.

[6]. Activating autophagy to potentiate immunogenic chemotherapy and radiation therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2017 Apr;14(4):247-258.

[7]. Epigenetic Control of Autophagy: Nuclear Events Gain More Attention. Mol Cell.2017 Mar 2;65(5):781-785.

[8]. Pharmacological modulation of autophagy: therapeutic potential and persisting obstacles. Nat Rev Drug Discov.2017 Jul;16(7):487-511.