細菌內毒素檢查法又稱鱟試劑法,是利用鱟試劑與細菌內毒素發生凝集反應,以檢測或量化藥品中因革蘭陰性菌產生的細菌內毒素含量是否符合規定的一種方法。此法以其快速、靈敏、經濟、重現性好等特點得到了日益廣泛的應用,并有取代傳統的熱原檢查法的發展趨勢。
1956年,美國動物學家Bang首先發現,給美洲鱟注入革蘭陰性細菌后引起全身性
血液凝固。1968年,美國血液工作者Dr r. Levin與Bag初步闡明這種血液凝固是由于革蘭陰性細菌內毒素激活了鱟血變形細胞溶解物的酶,使溶解物中的可溶性蛋白變成凝膠。這種凝固反應極其靈敏,當內毒素濃度達0001ug/ml即足以產生陽性結果。20世19紀70年代,美國提取變形細胞溶解物制成試劑,創建了檢測微量內毒素的檢測技術。
細菌內毒素檢查包括兩種方法,即凝膠法和光度測定法,后者又包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時,可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時,除另有規定外,以凝膠法結果為準。細菌內毒素的量用內毒素單位(EU)表示。
(一)標準品
細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價,用于試驗中的鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。
(二)檢查前的準備工作
1.試驗器材處理試驗所用的器皿需經處理,去除可能存在的外源性內毒素。常用的方法是在250℃干燥至少30分鐘,也可用其他確保不干擾細菌內毒素檢查的適
宜方法。若使用塑料器械,如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等,應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器械。
2.供試品溶液的制備某些供試品需進行復溶稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH在6.0～8.0。
3.內毒素限值的確定藥品、生物制品的細菌內毒素限值(L)一般按式 L=K/M確定。
式中,l為供試品的細菌內毒素限值,以EU/ml、EU/mg或EUU(活性單位)表示;K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量,以EU/(gh)表示;M為人用每千克體重每小時最大供試品劑量,以m(kgh)、m/(kgh)或U/(kgh)表示,人均體重按60kg計算,注射時間若不足1小時,按1小時計算。
4.確定最大有效稀釋倍數(MVD)最大有效稀釋倍數(MVD)是指供試品溶液被
允許稀釋的最大倍數,在不超過此稀釋倍數下可進行內毒素限值的檢測。一般按式MVD=CL/λ確定 。
式中,L為供試品的細菌內毒素限值;C為供試品溶液的濃度,當L以EU/ml表示時,則C等于1.0ml/ml,當L以EU/mg或EU/U表示時,C的單位需為mg/ml或U/ml為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml),或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。
(三)檢查方法凝膠法
凝膠法是一種限量法,是經典的細菌內毒素檢查法。凝膠法系指通過鯊試劑與內0毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。在本檢查法規定的條件下,使截試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為試劑的標示靈敏度,用Eml表示
1.試劑靈敏度復核試驗當使用的試劑批號改變或試驗條件發生了改變可能會影響檢驗結果時,需要進行試劑靈敏度復核試驗。在細菌內毒素檢查法規定的條件下,能使鱟試劑產生凝集的標準內毒素的最低濃度稱為靈敏度。單位為EU/ml。常用鱟試劑的靈敏度:0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml。
根據鱟試劑靈敏度的標示值(λ),將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解,然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ共4個濃度的內毒溶液。《中國藥典》二部要求將細菌內毒素國家標準品用細菌內毒素檢查用水溶解后需要在旋渦混合器上混勻15分鐘,以后每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒。
在16支試管中分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液,即每一個濃度平行做4支試管;在2支試管中加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照將試管中溶液輕輕混勻后,封閉管口,垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中,保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出,緩緩倒轉180°,若管內形成凝膠,并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性;未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程中應避免受到振動,造成假陰性結果。
若最大濃度2管均為陽性,最低濃度0.5管均為陰性,陰性對照管為陰性,試驗方為有效。按式計算反應終點濃度的幾何平均值,即為試劑靈敏度的測定值(λc)
式中
,為反應終點濃度的對數值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。
當λ在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)時,方可用于細菌內毒素檢查,并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。
2.干擾試驗內毒素試驗是試劑在無干擾的條件下與內毒素的一種凝集反應,當進行新藥的內毒素檢查試驗前,或無細菌內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時須進行干擾試驗;當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時,須重新進行干擾試驗。試驗方法如下。
(1)按表1制備溶液A、B、C和D,使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數(MVD)的溶液,按照鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。
(2)當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性,并且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度復核范圍內時,試驗方為有效。
當E在0.5-2(包括0.5A和20及E在0.5E,-2E(包括0.5E,和2E)時,認為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MD的稀釋倍數下對試驗有干擾,應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋,再重復干擾試驗。
可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效排除干擾且不會使內毒素失去活性,要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。
3.凝膠限量試驗按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數為MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。
(四)結果判定
保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。
1.若陰性對照溶液D的平行管均為陰性,供試品陽性對照B的平行管均為陽性陽性對照溶液C的平行管均為陽性,試驗有效。
2.若溶液A的兩個平行管都為陰性,判供試品符合規定。
3.若溶液A的兩個平行管均為陽性,判供試品不符合規定。
4.若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性,另一管為陰性,需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管,若所有平行管均為陰性,定供試品細菌內毒素符合規定否則判定供試品細菌內毒素不符合規定。
(五)注意事項
1.試劑生物活性在pH6.0～8.0時酶活性穩定,pH≤3或≥10時,酶活性受到抑制,故試驗時,供試品溶液pH應調節至6.0～8.0
2.試驗操作過程應防止微生物的污染,水浴保溫時應避免強烈震動。混合時應使用旋渦混合器,注意試管一定要垂直于插盤。試管溶液最好以不超過試管高度的1/3為宜。