細菌簡單染色實驗

實驗方法原理

常用堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷）。因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別，常用作簡單染色的染料有：美藍、結晶紫、堿性復紅等。

當細菌分解糖類產酸使培養基 pH 下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。

實驗材料 枯草芽孢桿菌 （12-18 h 營養瓊脂斜面培養物）藤黃微球菌（約 24 h 營養瓊脂斜面培養物）

試劑、試劑盒 呂氏堿性美藍染液／草酸按結晶紫染液齊氏石炭酸復紅染液

儀器、耗材 顯微鏡酒精燈載玻片接種環雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯）擦鏡紙生理鹽水

實驗步驟

1. 涂片

取兩塊載玻片，各滴一小滴（或用接種環挑取 1~2 環）生理鹽水（或蒸餾水）于玻片中央，用接環以無菌操作（圖 IV-1）分別從枯草芽泡桿菌和藤黃微球菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻井涂成薄膜。若用菌懸液（或液體培養物）涂片可用接種環挑取 2~3 環直接涂于載玻片上（圖 IV-2）。

2. 干燥

室溫自然干燥。

3. 固定

涂面朝上，通過火焰 2~3 次。

此操作過程稱熱固定，其目的是使細胞質凝固，以固定細胞形態。并使之牢固附著在載玻片上。

4. 染色

將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。呂氏堿性美藍染色 1~2 min，石炭酸復紅（或草酸銨結晶紫）染色約 1 min。

5. 水洗

倒去染液。用自來水沖洗，直至涂片上流下的水無色為止。

6. 干燥

自然干燥，或用電吹風吹干，也可用吸水紙吸干。

7. 鏡檢

涂片干后鏡檢。

注意事項

1. 載玻片要潔凈無油斑，滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要涂抹均勻。不宜過厚。

2. 熱固定溫度不宜過高（以玻片背面不燙手為宜），否剿會改變甚至破壞細胞形態。

3. 水洗時不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。

4. 涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。