實驗方法原理 置換型載體（如 λ2001、λDASH、EMBL 系列、Charon 34、Charon 35 和 Charon 40 ) 含有一系列的限制位點，它們在中央填充片段的兩端以相反方向排列（Frischaufet al. 1983）。
實驗材料 噬菌體 T4 DNA 連接酶限制性內切核酸酶λ 噬菌體包裝混合物
試劑、試劑盒 ATP氯仿乙醇酚：氯仿乙酸鈉焦糖凝膠上樣緩沖液
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP ( 10 mmol/L)
氯仿
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)
蔗糖凝膠上樣緩沖液
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌體（置換型載體）DNA
5. 專用設備
預置于 68℃ 的水浴
6. 載體和菌株
λ 噬菌體包裝混合物
二、方法
1. 將從置換型載體中純化的 25~50 μg λ 噬菌體 DNA 與 TE ( pH 8.0 ) 混合至終體積為 170 μl。
2. 加入 20 μl 兩者中任一適宜的 10X 限制酶緩沖液。取兩份未消化的 λ 噬菌體 DNA，每份含 0.2 μg，置于冰浴保存。
3. 加入 4 倍過量（100~200 單位）的兩者中任一適宜限制酶，按廠家推薦的溫度消化 4 h。
4. 將反應于冰浴冷卻至 0℃。再取出兩個 0.2 μg 的組分，將其中之一（另一份保存至步驟 10 中分析）與另一份未經消化的 DNA ( 步驟 2 ) 于 68℃ 溫育 10 min，以打斷噬菌體 DNA 黏性末端。加小量（10 μl ) 蔗糖凝膠上樣緩沖液，立刻將樣品加入至 0.7% 的瓊脂糖凝膠中。
5. 用酚: 氯仿抽提兩次和氯仿抽提一次以純化 DNA。
6. 用標準的乙醇沉淀回收 DNA。
7. 將 DNA 重溶于 TE ( pH 8.0) 中，濃度為 250 μg/ml。加入適宜的 10X 限制酶緩沖液，用第二種限制酶消化，同樣為 4 倍過量的酶反應 4 h。
8. 用酚: 氯仿抽提兩次和氯仿抽提一次以純化 DNA，用標準的乙醇沉淀回收 DNA。
9. 將 DNA 重溶于 TE ( pH 7.6 ) 中，濃度為 300~500 μg/ml，取一組分（0.2 μg）保存于 -20℃。
10. 為了檢測消化過程的有效性，用只經第一種酶消化的 0.2 μg 載體（步驟 4 中預留的組分）和最后制成的 0.2 μg 載體（步驟 9 ) 進行預連接反應。從每個連接混合物中取等量（0.1 μg）的 DNA 進行包裝，對獲得的噬菌體顆粒測定其滴度。
(1) 用水將 DNA 溶液的體積調整至 17 μl。
(2) 加入 2 μl 10X 連接緩沖液，如果必要，再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。
有些商品化連接緩沖液中含有 ATP。如果用這樣的緩沖液，就不再需要另加 ATP。
(3) 取 10 μl 步驟 (2) 中制成的混合物，冰浴保存。
(4) 在剩余的混合物（步驟(2) ) 中，加入 0.2~0.5 weiss 單位的 T4 DNA 連接酶，16℃ 溫育 2 h。
(5) 用一商品化的 λ 噬菌體包裝反應將 0.1 μg 的連接和未連接樣品以及 0.1 μg 的未消化載體 DNA 進行包裝。