絨毛標本分裂中期染色體涂片制備實驗

絨毛樣本

HBSS胰酶 EDTA HBSS 溶液膠原蛋白酶溶液完全培養基秋水仙胺枸櫞酸鈉甲醛 冰乙酸

無菌 Watchmaker 精細鑷冷試管搖床試管混合器Sorvall GLC-2B 離心設備HL-4轉子和6個 15ml 離心管塑料培養皿倒置顯微鏡或解剖顯微鏡熱氣增濕器空氣泵

基本方案

1.在倒置相差顯微鏡下用滅菌瓦氏精細鑷從母源蛻膜中仔細分離出絨毛。將絨毛轉入 HBSS 中清洗，更換 HBSS 直至絨毛洗凈。將絨毛分為兩部分，一部分用于培養 (第 2 步），其余用于直接制備（備選方案，第 1 步)。

2.將切細和洗凈的絨毛 4~10 mg 轉入含有 4 ml 胰酶/EDTA/HBSS 溶液的 4.5 ml 滅菌冷試管中。于搖床試管混合器上 37°C 孵育 60 min。室溫下 800 g 離心 5 min。

3.輕輕吸去胰酶溶液。加入 1.5~2 ml 的膠原蛋白酶溶液，于搖床試管混合器上 37°C 孵育 30 min。

4.室溫下 800 g 離心 5 min。輕輕吸去膠原蛋白酶溶液，余約 0.5 ml 于試管中。

5.用巴斯德吸管 (巴氏吸管）輕輕吹打域毛及剩余膠原蛋白酶溶液 10 次，將絨毛吹打成單個細胞懸液。在懸液中加人 3ml 預熱的 chang 原位培養基。

6.將 0.5 ml 單細胞懸液置于火焰滅菌的蓋玻片表面，放入 2~6 個標記過的 35mm 塑料細菌培養皿中。如果蓋玻片上的細胞懸液過濃（倒置顯微鏡下觀察），用 chang 原位培養基稀釋。培養 24 h。

7.每個皿中加入 2ml Chang 原位培養基，培養至細胞貼于蓋玻片上（2~3d)。

8.細胞貼于蓋玻片上之后，吸去培養基，加入 2ml 新鮮 chang 原位培養基，繼續培養。

最好的培養結果是僅僅從間質中心得到培養。如果. 有過多的碎片或母源細胞污染（懸浮細胞），則蓋玻片必須小心移入另外一個含 2 ml Chang 原位培養基中。

1~2d 后會出現類似于巢狀的成纖維細胞克隆，5~7d 的平皿培養后蓋玻片就可以準備收獲了，這取決于細胞生長和有絲分裂的活性（如克隆的數量和大小及分裂細胞的數量）。

9.每個皿中加入 10 ul 秋水仙胺，孵育 lh。從皿中移去培養基，加入 3 ml 預熱的以枸橡酸納。鮮育 20 min。

10.在皿中小心加入 2 ml 4°C 新鮮配制的固定劑，室溫下放置 2 min。

11.吸去枸櫞酸鈉/固定劑溶液，再次加人 2 ml 4°C 新鮮配制固定劑。放置 20 min。再重復固定兩次，第一次固定 20 min，第二次固定 10 min。

12.吸去固定劑，除去多余液體，立即干燥蓋玻片。將蓋玻片表面暴露于熱氣中 1~3s。立即將蓋玻片表面置于空氣泵栗出的柔和氣流中。如需要可以觀察蓋玻片表面以保證均勻干燥及調整氣流。

蓋玻片的正確干燥是整個實驗成功的關鍵。

13.倒置顯微鏡下觀察蓋玻片，判斷染色體分散的程度。如需要可調整干燥程序以便得到更好的分裂相。

14.用胰酶-吉姆薩顯帶法對染色體染色。

15.對 7~10 個中期分裂相拍照分析，對 2 個中期分裂相拍照并進行核型分析（附錄 3K)

備選方案 直接法制備絨毛分裂中期染色體涂片

中期分裂相涂片可從滋養層細胞（細胞滋養層的郎格漢斯細胞）自發的有絲分裂或經過有限周期（如僅僅數小時）培養的滋養層獲得。

1.將培養法中沒有用到的剩余絨毛放入盛有 3 ml 已預熱至 37°C 的完全 RPMI/含 1% 慶大霉素的 20%FBS 的培養皿中。培養 3 h 以上（絕不能少于 3 h)。

2.加入 lO mmol/L 的 FUdR(終濃度 3.3X10^-7mol/L)0.1 ml 使培養同步化。培養 15~17 h。

3.加入 lmmol/L 的胸腺嘧啶核苷（終濃度 3.3X10^-5mol/L)0.1 ml。培養 5 h(如果對分裂中期收獲率無不利影響，在胸腺嘧啶核苷中培養的時間可以 3~8 h 不等）。

4.加入秋水仙胺使其終濃度為 0.5ug/ml，孵育 2 h。從培養箱中取出培養皿，用巴氏吸管輕輕吸去培養基。

5.緩慢加人 3 ml 37°C1% 枸櫞酸鈉，孵育 20 min。小心加人0.5 ml 4°C 固定劑終止枸櫞酸鈉的低滲作用。

6.吸去枸櫞酸鈉/固定劑溶液，加入 2 ml4°C 新鮮配制固定劑。搖晃培養皿沖洗絨毛，吸去固定劑。再加人 2 ml 固定劑置于冰箱中過夜（如需 24 h 內出結果則置于冰箱中 20 min)。

7.移去固定劑并于室溫下放置 1~2 min，使殘余固定劑蒸發。

8.加入 100~200 ul 60% 冰乙酸。于倒置相差顯微鏡下觀察細胞從絨毛中釋放的情況。

輕柔振蕩。當細胞的釋放非常明顯（單個細胞從組織中游離）時即可制片。檢查單個漂浮細胞的數量。

用涂布器制片

9a. 將一張標記好的玻片置于已達到 45°C 的玻片加熱裝置的表面。滴 100ul 混合好的細胞懸液于玻片上，用涂布器輕輕將細胞懸液涂布于整個玻片。

10a. 不用涂布爭涂布玻片表面，用另一只手緩慢移動玻片，涂布器就可以使細胞懸液沿著玻片軸方向分散覆蓋玻片中心 50%~60% 的區域。來回重復 3~5 次，每個來回 30~60s(共 3~5 min)，使細胞懸液充分鋪開且干燥。

11a. 從玻片加熱裝置上取出玻片，從玻片邊緣吸干殘余液體。在倒置顯微鏡下觀察分裂相分散鋪片情況。玻片染色前于 65°C 恒溫箱中過夜或 90°C 恒溫箱中 10 min(第 12 步)。

用制片機制片

9b. 將制片機溫度調至 45°C，將標記好的玻片置于玻片架上。每張玻片上滴 100ul 混合好的細胞懸液，下降梳齒（制片機一次可制 6 張玻片）。

10b. 運行制片機 4~5 min。取出玻片，從玻片邊緣吸干殘余液體。在相差顯微鏡下觀察分裂相分散鋪片情況。玻片染色前于 65°C 恒溫箱中過夜或 90°C 恒溫箱中 lOmin。

進行第 12 步。

12.用胰酶-吉姆薩顯帶法對染色體染色（單元 4.3)。對 7~10 個中期分裂象進行結果分析。