結晶紫法對TNF生物活性的檢測

實驗概要

TNF包括TNFα與TNF?兩型，它們具有極其相似的生物學活性，在體內外可對一些腫瘤細胞或細胞系起殺傷作用，而對正常細胞則無細胞毒效應。根據這一特點，可利用TNF對敏感靶細胞的細胞毒效應，在體外檢測TNF的活性水平，既可檢測分泌型TNF(sTNF)，也可檢測膜結合型TNF(mTNF)。最常用的方法是體外檢測TNF對小鼠成纖維瘤細胞(L929細胞)的細胞毒效應。本實驗應用結晶紫法對TNF的生物活性進行了檢測。

實驗原理

TNF對L929細胞有細胞毒作用，如同時加用轉錄抑制劑放線菌素D，則可提高L929細胞對TNF的敏感性10～100倍。利用染料結晶紫或MTT可使活細胞染色，再用脫色液將染料脫出，測定其OD值，即可反應細胞的存活狀態或TNF對L929細胞的殺傷率，通過計算細胞死亡率，并與sTNF標準品對照，即可檢測待測樣品sTNF活性單位。

主要試劑

1. TNF標準品：作倍比稀釋(100 U/ml～0.1 U/ml)。

2. 0.25%胰蛋白酶

3. RPMI-1640培養液及PBS

4. 0.25%結晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/ml MTT(溶于PBS中)

5. 放線菌素D(分存液濃度為100 ug/ml)

6. 檸檬酸鈉緩沖液(0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液)；酸化異丙醇(0.04mol/L HCL異丙醇)

主要設備

1. 96孔細胞培養板，刻度吸管，毛細吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機，細胞計數板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO₂培養箱。

2. 酶標測定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。

實驗材料

1. L929細胞株(存活率應＞95%)

2. 待測樣品：作倍比稀釋至少6個不同稀釋度

實驗步驟

1. 取對數生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長培養液；

2. 用RPMI-1640培養液調L929細胞濃度為2×10⁵/ml；

3. 將上述細胞懸液加至96孔培養板，100 ul/孔；

4. 置37℃，5% CO₂培養箱中培養24h；

5. 吸去細胞培養上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品和待測樣品，100ul/孔，各設雙復孔，并設培養液陰性對照及空白對照(即L929細胞、標準品及待測樣品均不加入，僅加培養液)；

6. 同時向各孔均加入10ul放線菌素D(0.5～1μg/孔)；

7. 置37℃，5% CO₂培養箱中培養12-14h；

8. 甩棄上清，并用RPMI-1640培養液洗細胞1次；

9. 每孔均加入0.25%結晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min；

10. 甩棄上清，再用PBS洗板3次；

11. 室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔；

12. 充分混勻后，用酶標儀以檢測波長570nm，參考波長630nm測各孔OD值。