結構生物學領域迎來“不結晶”革命

　　 在英國劍橋市一座鋼結構建筑深處的地下室里，一場大規模的“叛亂”正在上演。

　　一個約3米高的龐大金屬箱正通過消失在屋頂上的橙色粗電纜，靜悄悄地發射兆兆字節的數據。這是全球最先進的冷凍電子顯微鏡之一：一臺利用電子束為冷凍的生物分子成像并揭秘其分子形狀的設備。英國醫學研究委員會分子生物學實驗室（LMB）結構生物學家Sjors Scheres像個矮子一樣站在這臺價值500萬英鎊（合770萬美元）的設備旁邊介紹說，這臺顯微鏡非常敏感，以至于一個叫喊聲就能毀掉試驗。

　　在全球實驗室中，類似這樣的冷凍電鏡正影響著結構生物學領域。過去3年里，它們揭示了制造蛋白的核糖體細節，而這些發現正在以飛快的速度發表于頂級期刊。結構生物學家們毫不夸張地認為，他們的領域正處于一場革命當中：冷凍電鏡能快速創建那些抗拒X射線結晶學和其他方法的分子的高分辨率模型。與此同時，利用此前技術獲得諾貝爾獎的實驗室正爭先恐后地學習這種“新貴”方法。

　　挑戰“王者”

　　當1973年生物學家Richard Henderson到LMB研究一種被稱為菌視紫紅質的蛋白時，利用光能量推動質子穿過細胞膜的X射線結晶學是毫無疑問的“王者”。Henderson和他的同事Nigel Unwin利用這種蛋白制成二維晶體，但它們并不適合X射線衍射。因此，兩人決定嘗試電子顯微鏡。

　　當時，電子顯微鏡用于研究被重金屬染色劑處理過的病毒或組織切片。一束電子被射向樣品，其中掙脫開來的電子被探測到并用于描繪它們所撞入的材料結構。這種方法產生了煙草病菌的首幅清晰圖像，但染色劑使觀察單個蛋白變得困難，更不用說X射線所能揭示的原子水平上的細節。

　　在一個關鍵步驟中，當Henderson和 Unwin利用電子顯微鏡對菌視紫紅質的晶片進行成像時，他們省略了染色劑，相反把晶體放在金屬網格上，以便使蛋白凸顯出來。“你能看到蛋白中的原子。”和Unwin在1975年發表了菌視紫紅質結構的Henderson介紹說。“這是一個巨大的進步。”美國加州大學舊金山分校細胞生物學家David Agard表示，“這就是說，利用電子顯微鏡研究蛋白結構將成為可能。”

　　冷凍電鏡領域在上世紀八九十年代得到發展。一個關鍵進步是將液態乙烷用于瞬間凍結溶液中的蛋白并使其保持靜止。不過，通常情況下，這種技術仍然只能將蛋白結構解析到10埃（1埃相當于1納米的十分之一）的分辨率——與X射線晶體學超過4埃的模型相比并沒有競爭力，并且遠遠無法滿足將這些結構用于藥物設計的要求。當諸如美國國立衛生研究院等資助者把上億美元投資到野心勃勃的晶體學項目時，對冷凍電鏡的資助遠遠落后于此。

　　1997年，當Henderson參加關于3D電子顯微鏡的年度高登研究會議時，一位同事在開幕式上發表了頗有挑釁意味的聲明：冷凍電鏡是一種“小生境”方法，不可能取代X射線晶體學。不過，Henderson能看到一個不同的未來，并且在隨后的演講中進行了反駁。“當時我說，我們應當讓冷凍電鏡在全球統治所有結構學方法。”他回憶道。

　　革命從此開始

　　此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實現了各種技術改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數碼相機風靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專家仍然偏好過時的膠片，因為它能比數字傳感器更高效地記錄電子。不過，和顯微鏡生產廠商一道，研究人員開發出遠超膠片和數碼相機探測器的新一代直接電子探測器。

　　這些從2012年左右獲得應用的探測器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時，諸如Scheres等研究人員編寫了復雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉變成在很多情況下可與晶體學解析的分子圖像質量相媲美的3D模型。

　　冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會四處晃動的穩定、大型分子，因此通常由幾十個蛋白制成的分子機器是很好的目標。而研究證明，沒有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過X射線晶體學解析核糖體結構的方法，讓3位化學家獲得了2009年諾貝爾化學獎。過去幾年里，不同的研究團隊迅速發表了來自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結構，包括首個人類核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎的Venki Ramakrishnan領導的LMB實驗室，X射線晶體學在很大程度上變得無人問津。他認為，對于大型分子來說，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學技術的預測是可靠的”。

　　今年5月，加拿大多倫多大學結構生物學家John Rubinstein和他的同事利用約10萬幅冷凍電鏡圖像，創建了一種名為V-ATPase、形狀類似轉子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過燃燒三磷酸腺苷（ATP）推動質子進出細胞液泡。“我們看到的是一切事情都在靈活進行。”Rubinstein說，“它在彎曲、扭動和變形。”在他看來，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。

　　統治結構生物學領域

　　像任何新興領域一樣，冷凍電鏡領域也有著成長的煩惱。一些專家擔心，競相利用此項技術的研究人員會產生有問題的結果。2013年發表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結構，便受到科學家的質疑。他們認為，用于構建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團隊產生的X射線和冷凍電鏡模型對原始模型提出了挑戰，但這些研究人員一直堅守他們的成果。

　　今年6月，在高登會議上，想要更多質量控制的研究人員通過一項決議，督促各期刊為審稿人提供關于冷凍電鏡結構如何被創建的細節資料。

　　成本也會減緩此項技術的擴散。據Scheres估算，LMB每天花費約3000英鎊運行其冷凍電鏡設備，還要加上1000英鎊的電費。大部分電費是由儲存和處理圖像所需的計算機產生的。“對于很多實驗室來說，這是一項很高的開支。”

　　為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預定時間的共享設備。霍華德·休斯醫學研究所（HHMI）在其弗吉尼亞州珍利亞農場校區運營著一個對HHMI資助的研究人員開放的冷凍電鏡實驗室。在英國，由政府和惠康基金會資助的一臺全國性冷凍電鏡設備，今年在牛津附近的迪德科特開始運行。“人們想要了解冷凍電鏡，已成為當下的一股浪潮。”幫助建立上述設備的倫敦大學伯克貝克學院結構生物學家Helen Saibil表示。

　　追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學生物物理學家Rod MacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結構而共同分享了2003年諾貝爾化學獎，但如今卻在深入研究冷凍電鏡。“我正處在學習曲線的陡坡上，而這總是令我興奮不已。”MacKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開和關閉的。

　　當Henderson在1997年反駁說冷凍電鏡將統治結構生物學世界時，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預言已不像當時看上去的那么夸張。“如果繼續發展下去，并且所有技術問題都得到解決，冷凍電鏡確實會成為一種占據統治地位的技術，而不僅僅是第一選擇。”Henderson說，“我們或許已經成功了一半。”