1、診斷：維生素B6缺乏癥的診斷依據是根據病史、癥狀、體征和必要的實驗室檢查。后者包括直接法(血漿、血紅細胞或尿中維生素B6水平及其代謝產物的測定)和間接法或功能測定。
2、實驗室檢查：
（1）直接測定：
直接測定血漿維生素B6水平，正常一般大于40nmoL/L。
測定維生素B6的代謝產物：最常用的是測定血漿中5-磷酸吡哆醛(PLP)，它與組織維生素B6的相關性好，但對攝入量的反應緩慢，約10天才能達到穩定狀態。目前是評價維生素B6營養狀況的最好指標，以血漿PLP大于20nmol/L為正常。但在評價時應考慮影響PLP濃度的各種因素，當蛋白質攝入增加、堿性磷酸酶活性升高、吸煙和年齡增長等都可使PLP水平下降。
測定尿中排泄的代謝產物4-吡哆酸，如每天排泄少于1.0mg，常提示維生素B6缺乏。4-吡哆酸的排出量幾乎能立即對膳食維生素B6攝入量反應，以大于3μmol/d為適宜營養狀態的指標。
（2）間接測定：
紅細胞天門冬氨基酸轉氨酶(α-Erythrocyteasparticacidtransaminase，α-EAST)和丙氨酸轉氨酶(α-Erythrocytealaninetransaminase，α-EALT)活性系數測定α-EAST和α-EALT經PLP活化已被廣泛用于評價長期維生素B6營養狀況。α-EAST活性系數大于1.6和α-EALT活性系數大于1.25作為維生素B6缺乏的指征。此方法目前已取代了色氨酸負荷試驗。
色氨酸降解產物的測定：色氨酸降解的主要途徑是需要PLP依存的尿氨酸酶。給予2g色氨酸口服劑量后，24h尿排出黃尿酸大于65μmol，考慮維生素B6缺乏。
3、其他輔助檢查：根據臨床表現可做血常規檢查是否有貧血。