綜述|mRNA疫苗設計創新和載體開發

　　前言

　　疫苗是預防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛生干預措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病，如天花和脊髓灰質炎，世界衛生組織估計疫苗每年可防止200-300萬人死于破傷風、百日咳、流感和麻疹。然而，盡管常規疫苗取得了明顯的成功，但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監視的病原體。此外，它們需要定期修改以應對快速變異的病原體，如流感病毒。

　　基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，希望能產生安全、多功能、易于生產的疫苗。mRNA疫苗比傳統疫苗有許多優點：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會整合到基因組中，從而避免了對插入突變的擔憂；mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造，從而實現快速、經濟、高效的生產。此外，單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強針對適應性病原體的免疫反應，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

　　最初，由于擔心其穩定性、低效性和過度免疫刺激，mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中，mRNA治療領域日新月異，包括mRNA藥理學的深入研究，有效載體的開發和mRNA免疫原性的控制，使得mRNA疫苗的臨床應用進入了一個嶄新的階段。

　　mRNA的設計與合成

　　體外轉錄（IVT）mRNA模擬內源性mRNA的結構，有五個部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區（UTR），一個編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個PolyA尾。圖片

　　與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結構包含一個7-甲基鳥苷核苷，5′端結構會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協同工作，招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調節mRNA翻譯和半衰期。

　　編碼區兩側的5′和3′UTR調節mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位，來自高表達基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外，UTR可根據細胞類型進行優化，如通過去除3′UTR中的miRNA結合位點和富含AU的區域，將mRNA降解降至最低。

　　mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區那樣具有可塑性，但可以通過優化密碼子，從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發現人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗階段。

　　為了最大化翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別，保證了翻譯過程產生足夠水平的蛋白質。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略，由CureVac首創，使用序列工程化和密碼子優化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

　　除了mRNA序列的改進外，在簡化mRNA生產方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質粒在體外轉錄。另外，使用CleanCap的共轉錄封蓋技術，簡化了純化步驟。

　　mRNA疫苗的載體

　　由于mRNA較大（104–106Da）且帶負電，因此無法通過細胞膜的陰離子脂質雙層。此外，在體內，它會被先天免疫系統的細胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內應用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經為此開發了許多基于創新材料的解決方案。

　　脂質納米顆粒（LNP）

　　脂質納米顆粒是臨床上最先進的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準臨床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質，它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。

　　可電離脂質與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質帶正電荷并吸引RNA。此外，它們在內涵體的酸性環境中帶正電荷，這促進了它們與內涵體膜的融合，將其釋放到細胞質中。

　　DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質。通過設計提高DODMA的功效，產生了DLin-MC3-DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin-MC3-DMA還用于mRNA的遞送。

　　目前，學術界和工業界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產生了許多有效的脂質，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

　　除了尋求提高療效外，人們越來越關注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環金剛烷尾的脂質11-A-M58，和含有環咪唑頭的脂質93-O17S59，已被設計用于體內靶向T細胞。盡管機制尚不清楚，但這些脂質的環狀基團對于靶向T細胞至關重要。

　　盡管電離脂質可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質成分（膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質）也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質，它通過填充脂質之間的空隙來增強納米顆粒的穩定性，并有助于在攝取到細胞的過程中與內涵體膜融合。

　　輔助脂質通過促進有助于膜與內涵體融合的脂質相變來調節納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質的選擇取決于可電離脂質材料和RNA載體。例如，對于類脂質材料，飽和輔助脂質（如DSPC）最適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質（如DOPE）最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。

　　LNPs的聚乙二醇化脂質成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質（如DMPE或DMG）結合而成。親水性PEG可以穩定LNP，通過限制脂質融合調節納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂質。

　　聚合物和聚合物納米顆粒

　　盡管臨床進展不如LNP，但聚合物具有與脂質相似的優勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物，可通過內吞作用進入細胞。

　　聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應用。此外，已經開發出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA傳遞方面表現出色，尤其是對肺。

　　最近開發出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉運體（CARTs），它能有效地靶向T細胞，操縱T細胞是非常困難的，因此，CART 是一種極具吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。

　　其他遞送系統

　　除了脂質和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細胞中，這要歸功于其主鏈和側鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結合并形成納米復合物。例如，含有重復的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合細胞穿透肽。

　　富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。

　　最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細胞，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質中的機制尚不清楚。

　　mRNA疫苗技術創新

　　mRNA疫苗技術最重要的創新在于：mRNA 序列設計；開發簡單、快速和大規模生產 mRNA 的方法；開發高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

　　最近的一項研究使用了一種基于細胞培養的系統選擇過程來識別新的UTRs，它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質表達。與人類β-珠蛋白3’UTR的相比，這些序列可以誘導相關轉錄物產生大約3倍的蛋白質。

　　此外，最近報道了一種有趣的新疫苗形式，該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個mRNA，使其在細胞質中能夠復制。這種系統可以在非常低的劑量（50ng）就有效地誘導小鼠的保護性免疫反應。這些發現特別有吸引力，因為低劑量的使用降低了疫苗生產的成本。無遞送材料進一步降低了成本，簡化了制造，并且提高了疫苗凍干和在環境溫度下儲存的可能性。

　　在生產方面，除了cleancap技術外，最近開發了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素（一種廉價且豐富的多糖）來純化mRNA的簡單方法。研究證明，這種高度可擴展且廉價的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

　　在遞送材料方面，與基于聚合物的CART平臺類似，mRNA-LNPs也實現了選擇性T細胞靶向。一種新的平臺，稱為ASSET（錨定二級靶向單鏈抗體），其中T細胞特異性單克隆抗體與LNP相連，以靶向T細胞。這種靈活的平臺在mRNA疫苗和其他應用方面也有很大的潛力。

　　另外一種脂質復合物在全身給藥后優先靶向樹突狀細胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導強烈的免疫反應是一個潛在的關鍵發現，該平臺已經在臨床試驗中證明了其前景。

　　小結

　　過去幾年在mRNA疫苗領域取得了極其重要的進展，并為這種新型疫苗模式的可行性提供了證據。新的制造方法和遞送材料將有助于快速、廉價地大規模生產下一代mRNA疫苗。同樣還有許多地方需要深入研究，以及更全面地了解各種mRNA疫苗類型的作用機制，以進一步地優化mRNA疫苗技術。

　　參考文獻：

　　1. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22.

　　2. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug；65:14-20.