基本方案
| 實驗方法原理 |
缺口平移是一種將標記核苷酸摻入到DNA中的方法，這些DNA可以是孤立的DNA片段或是一個完整克隆。該方法利用兩種酶的聯合作用：DNA酶I在DNA鏈上打開缺口形成3’端輕基，DNA聚合酶I在3’端羥基上加上核苷酸。隨著DNA聚合的進行，DNA聚合酶的5'—3'外切核酸酶活性將缺口5'端的核苷酸水解。反應進行過程中標記的和未標記核苷酸摻入，各種大小的DNA片段被合成，但是沒有DNA的凈合成。產生的雙鏈DNA片段在雜交前必須變性。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 待標記的樣品DNA 一般在50μL標記反應中含1μg DNA |
| 試劑、試劑盒 | 熒光素標記的dUTP 工作液濃度為0.2mmol L dATP、dCTP、dGTP、dTTP均0.3mmol L .缺口平移酶混合物 10×缺口平移緩沖液 TAE 緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 水浴鍋 PCR儀 |
| 實驗步驟 |
1.制備0.1mmol/L dTTP溶液：將100μL 0.3mmol/L dTTP加入到200μL無核酸酶的水中。 2.制備0.1mmol/L dNTP混合物：將0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP各100μL混合。多余的核苷酸混合物可在-20℃或-80℃保存。 3.對于每個標記反應，在放置在冰上的小離心管中加入1μgDNA、0.2mmol/L熒光基團標記的dUTP 2.5μL、0.1mmol/L dTTP 5μL、0.1mmol/L dNTP混合物10μL、10X缺口平移緩沖液5μL，加無核酸酶的水到40μL 4.每個小離心管中加入缺口平移酶混合物10μL。 5.混勻并稍離心。 6.在15℃條件下溫育8?16h。 7.加入5μL反應終止液。 8.為了去掉未摻入的核苷酸，加入乙酸鈉、125μL無水乙醇，用12000r/min的離心速度離心20?30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清。加入100uL70%乙醇，稍振蕩，用1500g離心5min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸去上清 9..用真空冷凍干燥器處理樣品.10?20min。用10pLTE重懸沉淀，使終濃度約為100ng/μL。也可以用Sephadex050型離心柱去掉未摻入的核苷酸，操作步驟按照產品說明書進行。用離心柱處理后，標記DNA體積范圍為50?100μL，然后按照步驟8進行濃縮。 10.為了確定標記DNA片段的大小，在50mLTAE或TBE緩沖液中加入0.5g瓊脂糖，用微波爐或電熱板小心加熱至沸騰。當瓊脂糖全部溶解，在水浴中降溫至55℃。 11.在瓊脂糖中加入2.5μL EB混勻后，將瓊脂糖倒在具有12孔或16孔梳子的鋪膠板上。 12.對于每個標記DNA樣品，將2μLDNA(約200ng)、7μL水（TAE或TBE)和1μL上樣緩沖液混合。 13.將每個標記樣品和分子質量參考在70?100V下電泳，直至前面的染液在凝膠中遷移約5cm。 14.在紫外投射反射儀上觀察DNA，并拍照。大部分的DNA片段應在200?600bp。
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