美希索中克隆培養

實驗方法原理 將細胞懸浮在含美希索的培養基中，將這種細胞種于鋪有瓊脂（或瓊脂糖）凝膠底層的培養皿中。

實驗材料 Noble瓊脂Difco胎牛血清1.6%美希索

儀器、耗材 兩倍濃度培養基生長培養基無菌超純水無菌錐形瓶吸管通用容器培養皿水浴三角瓶托盤電子細胞計數儀本生煤氣噴燈

實驗步驟

1. 按照 14.4 實驗中步驟 1~7 制備瓊脂凝膠底層。

2. 用等體積 2× 培養基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配2× 培養基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清）稀釋美希索（1.6 %美希索，4 Pa-S(4000cps)，以 UPW 溶解，置于冰上）至 0.8 % ，充分混勻，冰上保存。

3. 胰蛋白酶消化單層貼壁細胞，收集懸浮細胞或骨髓細胞，計數。

4. 制備以下稀釋濃度的細胞，細胞的最高濃度為 1×105 /ml 。

(a)1×105 /ml

(b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml

(c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml

(d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml

美希索有黏性，用不帶針頭的注射器更容易操作。

5. 將四種稀釋度分別標在 4 個小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 稀釋液，分別放人相應容器內，再向每個容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培養基，用漩渦混旋器充分混勻，如果細胞特別脆弱，用注射器（用于分裝美希索。由于黏稠，美希索會附著于吸管內壁，造成分裝量不準確）上下輕柔地抽吸溶液幾次，然后用注射器再從每個容器中吸出 3 個 1 ml 分別加在相應的三個培養皿上。最終濃度如下：

(a) 1×105 /ml/皿

(b) 330 /ml/皿

(c) 110 /ml/皿

(d) 37 /ml/皿

6. 將培養皿放置在加濕的溫箱屮培養至集落形成。由于集落會在瓊脂與美希索的界面形成，所以培養 1 周后添加新鮮培養基 1ml/皿或孔，2 周后在不影響集落的情況下，棄舊液，更換更多新鮮培養基。