羥基磷灰石柱用于蛋白質層析實驗

實驗步驟

一、機制

從 1971 年（Bernardi，1971;Gorbunoff，1990) 就已經幵始定期發表關于 HA 對蛋白質吸附與解吸附的綜述。最近的一篇文獻 (Kandorietal.，2004) 引用了較早闡述的機制，酸性蛋白質通過 C(鈣)-位點結合, 而堿性蛋白質通過 P(磷酸鹽)-位點結合。C-位點和 P-位點首先由 Kawasaki 等 (1986) 提出，隨后 Gagnon(1996)Xt 其進一步探討并強調了 C-位點在單克隆抗體純化中的重要性: 部分單克隆抗體的結合是通過鈣配位絡合物 (calciumcoordinationcomplexe) 與抗體中的羧基簇（carboxylcluster) 發生作用。HA-蛋白質間的相互作用可簡化為下述內容: 氨基可以吸附于 P-位點，但受到 C-位點的排斥; 對于羧基來說，情況相反且更復雜。盡管胺類可以結合于 P-位點，但是其羧基最初是通過靜電作用與 C-位點相互吸引的，與 C-位點的結合還涉及比陰離子交換更強的螯合配位鍵。

例如，Kawasaki(1991) 所述，對于蛋白質和其他溶質與 C-位點的相互作用，磷酰基比羧基更強。

Don 等 (2007) 進一步的研究工作圍繞骨-蛋白質間的相互作用展開，目的是研究蛋白質中凈電荷為 o 的一 OH 基和一 NH2 基與 HA 表面的機械作用。受控分子動力模擬表明，HA 表面與骨形態形成蛋白（bonemorphogeneticprotein)(用于骨形成的生長因子）的一 0 H 基和_NH2 基通過水橋 (water-bridged)H-鍵形成強相互作用。Shen 等 (2008) 用纖連蛋白片段（FN-DIlO) 證實了 Don 等的觀察結果。上述及一些類似研究均支持 C-位點和 P-位點模型。HA 表面已經分別建議用于組氨酸標記蛋白質 (如六聚組氨酸標記的蛋白質) 的純化, 以及富含組氨酸的免疫球蛋白 G(IgG) 的純化 (Ngetal.，2007)。在這種情況下，基于六聚組氨酸標記的和未標記的融合蛋白質的共洗脫，轉-組氨酸的相互作用會顯得很輕微。蛋白質吸附機制與 Gorbunoff(1990) 先前所述一致，引入水橋 H-鍵作用機制是對其進行了改進。

如果上樣緩沖液中含有磷酸鹽，那么有些蛋白質將不會吸附于 HA。Ferguson 等 (1980) 提出，在這種情況下通常可以使用 Good’s 緩沖液。例如，Schirch 等 (1985) 純化的大腸桿菌表達的絲氨酸羥甲基轉移酶，首先通過陰離子交換獲得組分均一的樣品，再以 pH7.0,20 mmol/LJV，JV-2-(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸 (BES) 作為上樣緩沖液平衡 HA 層析柱，繼而采用較小的磷酸鹽梯度洗脫。

通過逆轉 P-位點相互作用、C-位點相互作用的兩種形式和/或 H-鍵，可以實現蛋白質解吸附。線性和分步梯度的磷酸鹽緩沖液是最常用的解吸附試劑。另外,Freitag 和 Breier(1995) 提出蛋白質可通過它們所帶的凈正電荷與 HA 表面所帶凈負電荷間的靜電作用而固定在層析柱中, 但可以向磷酸鹽緩沖液中加人陰離子使蛋白質去吸附, 或加人陽離子通過它們所帶的凈負電荷與 HA 表面的凈正電荷相互作用而使那些固定的蛋白質解吸附。Gorbunoff(1984a;l984b) 及 Gorbunoff 和 Timasheff(1984) 發表的一系列文章已經討論了 Cr、F’ClOr、SCN-和磷酸鹽的作用。Schktterer 等 (2006) 采用氟化物離子將前列腺素 D 合酶從陶瓷化 HA 層析柱上解吸附。該酶來自于牛的腦脊髓液, 吸附后，以含有 NaF 的 10 mmol/LpH6.25 的磷酸鈉緩沖液進行一系列地解吸附。他們分別以 150~750 mmol/LNaF 和 375~750 mmol/LNaF 作為線性梯度。

解吸附作用也明顯受緩沖液 PH 的影響。根據 Ogawa 和 Hiraide(1996) 的研究，在較低的磷酸鹽濃度條件下，PH 大于 7.0 時蛋白質的洗脫比 pH 小于 7.0 時更迅速，且 I 型和 n 型多孔陶瓷化 HA 的洗脫順序是相似的, 但是對于 I 型層析柱，蛋白質解吸附需要更強的磷酸鈉緩沖液。與此類似，在 pH 為 5.5~6.8 時，緩沖液的 pH 同樣會影響多孔陶瓷化氟磷灰石層析柱蛋白質的解吸附。表 24.1 比較了在上述范圍內，采用規格為 I-ICmX15 cm 的 I 型陶瓷化 HA 和陶瓷化氟磷灰石層析柱分離多種蛋白質的洗脫時間。該層析柱采用 pH10、0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液灌裝，再以 pH5.5、pH6.OSpH6.8 的 5 mmol/L 的磷酸鈉緩沖液平衡。蛋白質的洗脫順序并不是僅僅取決于其 PI。根據 Gorbunoff(1984a;1984b) 的觀點，某些蛋白質的解吸附還取決于它們的結構及羧基的含量。

二、化學特性

1.HA 表面的陽離子和陰離子修飾

鈣離子和鎂離子通過形成磷酸鹽-Ca 或磷酸鹽-Mg 橋而改變 HA 表面, 盡管最初提出是在 20 多年前，但是最近 Gorbunoff(1984a;1984b) 和 Gagnon 等（2009) 才使用 Ca-修飾的陶瓷化 HA 表面對從 Mab 和 Fc 抗體組分中純化 Fab 進行改進。這些研究表明，在經過 20 個柱體積的較低濃度磷酸鹽緩沖液的處理之后，Ca-修飾的陶瓷化 HA 可以恢復天然形式。

如 Krane 和 Glimcher(1962) 所述，HA 同樣具有高度的焦磷酸鹽（pyrophosphate,PR) 和多聚磷酸鹽親和力。在無水的磷酸二氫鈉和憐酸氫二鈉中，PH 是一種污染物，而且對于相應的兩種鉀鹽來說或許也是一種污染物。相對于^^八對蛋白質的吸附與解吸附，磷酸鹽緩沖液中存在的 PR 既有優點也有缺點。如圖 24.i 所示，采用無水的磷酸鈉配制的磷酸鹽緩沖液對牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原又和細胞色素 c 進行分離。圖 24,2 所示為采用 Na2 HPO347 氏 o 和 NaHJO4 h2o 配制的磷酸鈉緩沖液進行上述蛋白質的分離。用于層析柱的憐酸鈉緩沖液是采用無水磷酸鈉配制的，且進行了 4 個程序的循環以盡量降低 PR 的影響 (圖 24.1)。PPi 有助于 ha 對蛋白質的層析分離，尤其是對于一些弱吸附的蛋白質。然而，我們還必須謹慎操作，保證在所有的實驗間高階磷酸鹽的水平均保持一致，以避免人為失誤。

2. 金屬的吸附

多次使用后，金屬物質的累積會導致層析柱褪色。褪色原因可見于牙齒研究者對齲齒的研究、醫學研究者對骨骼完整性研究和組織液處理人造骨骼或尸體植入 (cadaverimplant) 的研究以及材料科學家對土壤污染物和金屬吸附的檢測。

依據 Shepard 等 (2000) 的研究，在進行若干個重組蛋白純化循環后, 陶瓷化 HA 層析柱會發生褪色。其層析工藝中，陶瓷化 HA 柱層析是繼陽離子交換和陰離子交換層析之后的第 3 個步層析。他們得出的結論是，使陶瓷化 HA 褪色的金屬物質有多種來源: 工藝用設備、試劑、水及發酵營養物。然而，層析柱褪色不會影響它們對于重組蛋白的純化。

農學家解釋為 HA 會優先吸附多價金屬（Maetal.，1 即 4)，并且證實 HA 對二價重金屬具有高吸附力。在陶瓷化 HA 層析柱褪色的過程中可以觀察到很多這種金屬物質，尤其是 Fe、Al、Zn 和 Mn。

3.HA 的可溶性

層析過程中會使用大量的緩沖液, 這會使層析柱的頂端產生空隙或者在 HA 中形成通道。HA 的溶解度常量為 2.4XKT59，相當于約 4ppm。磷酸根離子和堿性 pH 抑制 HA 的溶解。然而,HA 可以從非常稀的溶液中吸附蛋白質, 如 Immol/L(pH6.8) 磷酸鹽緩沖液，并且可以是無緩沖能力的堿性金屬溶液, 通常為 Immol/L 的 NaCl、KCl 或兩性離子緩沖液。Schirch 等（W85) 證實某些酸性蛋白質僅在水中被吸附。正如 Scopes(1993) 所解釋的，較低的無緩沖載荷條件可降低對 HA 表面 pH 的控制。研究者們 (Schroderetal.，2003) 指出，可以在磷酸鹽緩沖液中使用 4-X#氧氮己環丙磺酸 (4-morpholinepropanesulfonicacid，MES) 來保持磷酸鹽洗脫，同時還能夠維持上樣緩沖液和洗脫緩沖液的 pH。然而，即使使用磷酸鹽抑制 HA 的溶解，但其溶解性仍是一個危險因素。例如，采用 2*0 mmol/L、pH6.5 的磷酸鈉平衡層析柱，并用平衡緩沖液上樣，繼而在 20 mmol/L 磷酸鈉緩沖液中增加 NaCl 濃度進行連續洗脫。如此不斷循環后，層析柱中會形成空隙并且壓力增加。這些空隙和產生的壓力是由于 HA 受到了化學損傷，這主要是 HA 表面積累的水合氫離子的解離導致的。圖 24.3 所示為流出液的 PH 變化以及水合氫離子吸附 (A 和 B) 和解吸附吸附 (C 和 D) 區域。

Harding 等（2005) 認為水合氫離子的吸附與解吸附是 HA 電荷零點（zeropointcharge) 發揮作用。并且研究 (SkartsilaandSpanos,2007) 證明了電荷零點、pH、水合氫離子吸附與解吸附和鈣離子含量間的關系。Skartsila 和 Spanos 所測得的電荷零點并不一致，分別為 7.3±0.1 和 6.5±0.2。這些研究同時還解釋了輸人緩沖液的 pH 與柱后流出液 pH 偏差間的區別。可以如此合理假設: 改變輸入緩沖液的 PH 或提高其緩沖能力，能夠降低 pH 變化的強度，同時也可能縮短該變化所持續的時間。然而，先前已經提到，當磷酸鹽的濃度太髙時，有些蛋白質無法吸附于 HA。如一些工藝開發工程師指出的，在某些情況下，即使 5 mmol/L 的磷酸鹽都能夠抑制蛋白質的吸附 (McCueetal.，2007)。

選擇合適的緩沖液可以有助于保持目標蛋白質的完整性，同時利于其吸附于 HA。這一步驟在平衡時最好已經完成，平衡時應該沒有任何的磷酸鹽，然后加載緩沖液。但是在經過幾個循環后，填充柱便失效了。研究表明，低至 2rmnol/L 的磷酸鹽可以延長層析柱的壽命，同時又兼顧目標蛋白質的純度。磷酸鹽與 MES 或與 3-(N-嗎啉代）丙磺酸 (MOPS) 及少量的鈣離子聯合使用，可充分抑制 HA 的溶解。這些工藝開發工程師并沒有明確地提到 pH 轉換 (McCueetal.，2007)。圖 214 所示為采用 MES 緩沖液的優點, 可以將圖 24.3 中所觀察到的 pH 變化及其持續時間最小化。兩種系統緩沖液的含高濃度 NaCl 的洗脫組分中均可以檢測到鈣離子。對于 0~02mol/L 磷酸鈉緩沖液，鈣離子濃度為 36ppm; 對于 75 mmol/LMES/0.02mol/L 的憐酸鹽緩沖液，耗離子濃度為 5ppm。

三、純化操作規程的開發

大多數蛋白質能在具有較低離子強度的、濃度低至 I_ol/L 的磷酸鹽緩沖液中吸附于 HA。對于已經吸附的蛋白質, 通常采用含有 NaCl 或 KCl(鹽）的高濃度磷酸鹽洗脫。用其他類型解吸附溶液洗脫蛋白質并不常見。

如果蛋白質樣品中含有大量的鹽，那么可以對其進行足夠地稀釋，但磷酸鹽的濃度不得低于 Immol/L, 以保證樣品能吸附于 HA。如應用其他緩沖液，其濃度應足以控制 pH。首先以線性鹽梯度進行洗脫，檢測蛋白質是否能夠解吸附。若蛋白質仍結合于層析柱，那么可以采用線性磷酸鹽梯度作為洗脫液進行重復操作。檢測蛋白質的純度，確定洗脫蛋白質所需鹽濃度或磷酸鹽濃度，并將其用于純化方案中的洗脫步驟。比較分步洗脫和梯度洗脫所得蛋白質的純度。需要時可依此調整純化方案。如果需要將其他類型的結合蛋白質和生物組分與層析柱解吸附，可以先采用 3 個柱體積的、不含其他鹽類的、低離子強度 (LIS) 的磷酸鹽進行清洗，再以 3~5 個柱體積的、0.5mol/LpH7 的磷酸鹽緩沖液，3 個柱體積的、LIS 緩沖液以及 3~5 個柱體積的 0.5~1mol/LNaOH 進行清洗。準備用于下一輪分離的層析柱時，可以先釆用 3 個柱體積的 LIS 緩沖液，再以 3 個柱體積的、pH 與平衡緩沖液一致的、0.5mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗層析柱，最后加載 3 個柱體積的上樣緩沖液。

四、實驗室規模層析柱的填裝

實驗室規模 HA 層析柱的填裝方案因 HA 的來源不同而異。填裝 HAUltrogel 吸附劑時采用的層析柱，其髙/徑比值為 1~6，直徑為 1.6~5.0 cm。準備填裝用吸附劑時，應采用溫和地翻轉容器或者塑料攪拌器攪動的方式。將適當體積的吸附劑漿液倒入真空容器中，且后者的體積應約為目的填裝層析柱體積的 2 倍。然后，向其中另外加入約 40% 的水稀釋漿液。輕輕混合后, 連接真空泵除去其中未溶解的空氣。再緩慢地攪拌已脫氣的吸附劑，以獲得均勻的懸浮液。再一次性地將其倒人層析柱中，盡量不要使空氣進入漿液流中。待懸浮液沉降 5~10 min，直至層析柱頂端出現 Icm 清晰可見的清液層。

再將人口適配器插人層析柱中，并與液相層析設備相連，繼而采用水或者平衡緩沖液，以流速為 55~250 cm/h 運行, 具體流速取決于所需填充床的高度; 對于 20 cm 髙的填充床可用 55 cm/h 的流速,5 cm 髙的填充床則用 250 cm/h 的流速。調整人口適配器的位置, 使其接觸填充床的表面，進而排除截留的空氣。若有空氣突然侵入層析柱中，須按照上述步驟重新進行填裝。

CHT 是一種球狀的多孔陶瓷化介質。可與之相配的層析柱包括帶有可變高度適配器的 MilliporeVantageL 和 WatersAP，額定壓力在 3bar 以上。可根據填充床的尺寸及 CHT 的密度計算所需 CHT 的重量。例如，一個 I.Icm 內徑 X20.0 cm 髙度的填充柱，其體積為 19 mL，需裝入 12 gCHT。用塑料攪拌器將 CHT 懸浮于 3.5 倍體積的填充緩沖液 (0.2mol/LNa2P047 H20,pH9~10) 中。選擇的填充緩沖液，應至少具有 0.Imol/L 的離子強度并至少含有濃度為 20 mmol/L 的緩沖組分，pH 為 6.8~10。靜置懸浮液，使封閉于填料顆粒中的空氣分離出來。將填充延長管連接于層析柱，這樣便可以一步處理所有懸浮的陶瓷狀 HA。向層析柱/延長裝置中灌入填裝緩沖液, 并使其高度達到 1~2 cm。用塑料攪拌器攪拌燒杯中的填料顆粒使其懸浮，再倒入到層析柱/延長裝置中。用填充緩沖液清洗剩余的陶瓷化 HA，再倒人層析柱/延長裝置中。打開層析柱的出口，通過重力流動作用填裝陶瓷化 HA，直至高度恒定。關閉層析柱的出口，移走延長管, 然后插入入口適配器，使其降低至正好能夠接觸到重力作用填裝的陶瓷化 HA 表面。再將其與液相層析設備相連, 打開層析柱的出口, 用 3 個柱體積的填充緩沖液，以 250 cm/h 的流速平衡填充的陶瓷化 HA。調整適配器的位置，使其剛好可以接觸到因上述流動后所產生的陶瓷狀 HA 表面。若有空氣突然侵人到填充床中，通常可以在層析柱的調節步驟中將其排除。層析柱的調節步驟: 先采用 3 個柱體積的平衡緩沖液, 再以 3 個柱體積的 0.5~Imol/LNaOH、3 個柱體積的 0.4~0.5mol/L 的磷酸鈉緩沖液 (pH6.5~7.2) 和 3 個柱體積的平衡緩沖液處理層析柱, 使其適應新的環境。平衡緩沖液一般為離子強度較低的緩沖液，如 2~20 mm0l/L 的磷酸鹽，當磷酸鹽的濃度為 2~10 mmol/L 時, 需向其中加入 GoocPs 緩沖液。

微晶型 HA 可以從不同的公司購買到。將 Bio~GelHTP 和 HT 填充至層析柱之前，須進行相關的準備工作。緩慢地傾出 HT 的上清液后，加入等體積的填充緩沖液。通過旋轉容器懸浮 HT，將 2 倍于所需灌裝層析柱體積的懸浮液倒入燒杯中。沉淀懸浮液 30 min，再輕輕倒出上清液，其中可能含有細微顆粒。對于 HTP，每 2.5 mL 目標填裝體積對應 Ig 干粉。將粉末放置于燒杯中，容器體積應為目標填裝體積的 2~6 倍，并用塑料攪拌棒緩慢將其混合。沉淀懸浮液 30 min，再輕輕倒出上清液，其中可能含有細微顆粒。加人與目標填充體積相當的填充緩沖液，得到 50%(V/V) 懸浮液。用塑料攪拌棒輕輕攪拌以懸浮 HT 或 HTP。以漏斗或層析柱延長裝置將所有的懸浮液灌注到層析柱中。10 min 后, 打開層析柱的排出口，通過重力流作用灌裝層析柱。不要讓空氣突然侵人填充床中。當層析柱頂端剩余約 2 cm 緩沖液時，關閉排出口，移走延長管或漏斗, 再插入入口適配器，使其下降以排除其接入通路產生的空氣。繼續降低適配器的位置，直至其恰好接觸到重力形成的填充床表面。若采用 DNAGradeBio-GelHTP，準備工作和填裝均與 HTP 相似。HT 和 HTP 的最大流速為 100 cm/h;DNAGradeBio-GelHTP 的最大流速為 40 cm/h。對于 CalbiochemHydroxylapatiteFast；Flow 及其高分辨率層析柱的預處理及填裝分別與 HTP 和 DNAGradeBkKielHTP 相似。Clarkson 公司的陶瓷化 HA 與 HypatiteC 的預處理及填裝也與 HTP 和 HT 相似。

HA 的供應商通常不會列出全部的 HA 產品目錄。表 24.2 所列為 HA 和陶瓷化 HA 目前的一些供應商。

五、生產規模層析柱的填裝

對于填充良好的大規模層析柱, 從其頂端到底端，其中的填料是連續均勻分布的，并表現為最佳的層析效能。CHT 的填裝方法有數種，如何選擇取決于所用的層析柱類型及設備。在填裝層析柱前, 應參閱層析柱、介質轉移設備和介質填裝設備的相關指導手冊。

開放性層析柱的最大填充床高度不能高于介質固位板 (釉料或網狀物) 表面間距離的 50%，如 EasyPack(BiCrRadLaboratories)、BPG(GEHealthcare) 和 Moduline2(Millipore)。例如，若該距離為 54 cm, 那么最大的填充高度則為 27 cm。同時計算填充柱的體積。每升填充床體積，使用 630 g 干粉及 1.79L 填充緩沖液，以制備成 50%(V/V) 的漿液。關閉層析柱的排出口，導入填充緩沖液，隨后加入干粉。用塑料攪拌器攪動 CHT-緩沖液的混合物使干粉水化, 將兩者混合形成均質的漿液。再逆向攪拌以盡量減少漿液的移動。根據生產商的說明書安裝頂端的適配器，并將其插入至層析柱管體中。5 min 后形成無樹脂區, 降低適配器使內部空氣可以通過頂端的入口排出，并用填充緩沖液清洗適配器上的流動收集器和入口的線路。填充流速為 200~300 cm/h，并運行 2 個柱體積的填充緩沖液。一旦固定填充床，即可調低適配器，使介質固位板和填充柱頂端留有 1~5 mm 的空間。切記不要將適配器降至填充床中，避免造成 CHT 顆粒的不可逆損傷。

對于封閉型的層析柱，如 InPlace(Bio-RadLaboratories) 和 Bio-ProcessLPLC(GEHealthcare) 層析柱, 應在外部準備漿液, 再進行填裝。同開放型層析柱一樣，其最大的填充床高度不能髙于介質固位板 (釉料) 表面間距離的 50%。并計算填充柱的體積。

每升填充床體積, 采用 630 g 干粉及 1.79L 填充緩沖液，制備成 50%(V/V) 漿液。將填充緩沖液倒入介質漿液罐中，隨后加入干粉。通過剪切力較小的水翼葉輪 (A3 型) 攪動 CHT-緩沖液的混合物, 使干粉水化，并將兩者混合形成均質的漿液。再用介質轉移裝置將全部漿液轉移至層析柱中。以 50 cm/h 的流速排除漿液中的氣泡。停止運行，靜置 5 min 形成無樹脂區后，降低適配器使內部空氣可以通過頂端的人口排出，并用填充緩沖液清洗適配器上的流動收集器和入口的線路。填充時軸向流速為 200~300 cm/h, 以壓縮填充床。繼續調低適配器的位置, 直至介質固位板和填充柱頂端間相距 1~5 mm。當填裝不銹鋼的 InPlace 或 LPLC 層析柱時, 保持軸向流直至適配器達到距目標高度之上的 2 cm 后，降低流速到 10 cm/h，直至適配器的信號傳感器與填充床頂端接觸。

目前還并沒有采用微晶型 HA 填充生產規模層析柱。HAUltrogel 用于大直徑的淺層析柱。填裝這類層析柱及介質需要得到相應供應商的幫助。

關于填裝的生產用層析柱的評價，可根據管理機構的建議進行，這也是終端用戶通常需要的。美國食品與藥物管理局及歐洲、加拿大、日本和亞洲的相應機構已經發布了評價填裝層析柱的指導意見。一些層析介質的供應商也提出了對于實驗室規模和生產規模層析柱評價的簡單方法, 但是并沒有必要將兩者的結果相關聯。一些生物醫藥公司的創新者 (TeetersandQuiftones-Garda，2005) 是非常睿智的，他們提出采用停留時間分布 (residencetimedistribution，RTD) 來追蹤層析柱使用期限內填裝層析柱的狀態。

六、應用

在重組蛋白的純化方案中，采用線性或分步的磷酸鹽洗脫仍是占據主導地位的解吸附策略。對于在畢赤酵母中表達的人過氧化氫酶，采用 3 步工藝-硫酸銨沉淀、陰離子交換層析和 HA 層析，可使其純度達到 95%。以 0.05~0.3mol/L、PH6.8 的磷酸鹽線性梯度，可以將重組的過氧化氫酶從 HA 層析柱上洗脫。Shi 等 (2007) 從培養基中獲得分泌的過氧化氫酶，最終得率為 60%。如 Hsieh 等（2003)、St 垃 nsk^等 (2007)、Luellau 等 (1 卯 8) 和 Nuss 等 (2008) 所述, 用 HA 層析柱，并以線性或分步梯度的磷酸鹽可以純化多種蛋白質。

diSalvo 等 (2004) 在大腸桿菌中表達了人源及兩種大腸桿菌來源的卩比咳醛激酶 D 先用硫酸銨沉淀含有該酶的細胞裂解物顆粒，再采用磷酸鹽緩沖液將其溶解，之后以 3 種類型的層析介質-疏水作用凝膠、陰離子交換樹脂和陶瓷化 HA 進行純化。對于人吡哆醛激酶的 HA 純化, 采用 20 mmol/LN，iV-2-(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸鈉（BES)、pH7.3 作為吸附緩沖液, 以線性梯度到 100 mmd/L、pH7.3 的磷酸氫二鉀進行洗脫。Stuhlfelder 等 (2002) 用陰離子交換層析、凝膠過濾和陶瓷化 HA 層析進行了番茄 (1^吵^-sz’conescwZe 尬 mot) 細胞培養物的茉莉酸甲基水解酯酶（methyljasmonatehydrolyzingesterase) 的純化。在 HA 的純化步驟中，采用 20 mmol/L 的磷酸氫二鉀、20 mmol/L 的 p-巰基乙醇和 0.3 mmol/L 的氯化鈣，pH6.8 作為吸附緩沖液; 以線性梯度到 500 mmol/L 的磷酸氫二鉀、20_0l/L 的卩-巰基乙醇，pH6.8 的緩沖液進行洗脫。在最近的一個實用型ZL中，發明者采用多級的層析工藝 (親和層析、疏水作用層析、HA 層析和陰離子交換層析) 純化重組紅細胞生成素 (recombinanterythropoietin,rEPO)(Schumannetal.,2007): 在采用陶瓷化 HA 純化步驟中，以 20 mmol/LTris、5 minol/LCaCl2、250 mmol/LNaCl、9% 異丙醇、pH6.9, 作為吸附緩沖液。用 10 mmol/LTris、0.5 mmol/LCaCl2、10 mmol/LK2 HPO4，pH6.8, 作為 rEPO 的洗脫緩沖液。在關于 rEPO 的另一個純化工藝中, 發明者用 HAUltrogel 吸附劑，以含有 Imol/LNaCl 和 2 mmol/LCaCl2 的 0.05mol/LTris 緩沖液 (pH7.5) 平衡吸附蛋白質。用含 0.005%(OT/V) 聚山梨醇 80 的 20_ol/L 磷酸鹽緩沖液 (pH7.5) 洗脫 rEPO。

免疫球蛋白的純化也可以采用多步驟的層析工藝進行。例如，Leibl 等 (1996) 先后用肝素-親和層析和陶瓷化 HA 層析, 從人血清的 CohnFrGI 中進一步純化人免疫球蛋白 A(IgA)。其中陶瓷化 HA 層析步驟，以 10 mmol/L 的磷酸鹽、137 mmd/L 的 NaCl，pH7.4 緩沖液平衡, 同時輔以 IgA 肝素組分。再以 15.3 mmol/L 的磷酸鹽、287_ol/L 的 NaCUpH6.8 的緩沖液洗脫吸附的 IgA 單體，之后采用陰離子交換、分子篩、親和層析進一步純化 IgA, 去除其中的 IgG。在另外一個例子中，采用疏水性電荷誘導層析 (hydrophobicchargeinductionchromatography) 從鼠的腹水中分離單克隆 IgG(Mab)。Guerrier 等 (2001) 用 HAgel 分離 Mab 組分，先以 10 mmol/L、pH8 的磷酸鈉平衡，再以 0~5mol/L 的 KCUOmmol/L(pH6.8) 的磷酸鈉洗脫。Sinacola 和 Robinson(2002) 將 HA 作為精制步驟，可以從有活性的 scFv 中去除單鏈抗體 (scFv) 聚集物和無活性的單體 scFv。用 200 mmol/LNaCUmmol/L 乙二胺四乙酸緩沖液和 100 mmol/LTris-HCl，pH8.3 平衡時，有活性的 scFv 不能吸附于 HA。

臨床上, 高滴度表達的 Mab 通常含有大量的免疫球蛋白聚集物。在磷酸鹽洗脫體系中，HA 表面對單體和多聚體的選擇性一般是相同的。可以用 NaCl 從 HA 上面的多聚體中純化單體（Sun，2003)。詳細描述可見美國ZL 200501o7594。用 0.5mol/L、pH6.8 的磷酸鈉可以去除多聚物、內毒素和 DNA。采用磷酸鹽進行洗脫時，Gagnon(2008) 通過向緩沖液中加入 PEG 可使多聚體的去除效果顯著地提高。若洗脫液中加入高濃度的 PEG，單體將不會吸附于層析柱, 而多聚體、內毒素和 DNA 仍處于吸附狀態。

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