近年來，高通量單細胞轉錄組測序已廣泛應用于動物細胞研究，但只在少數植物物種和組織的研究中存在報道。其主要原因是因為植物細胞比動物多了一層細胞壁，使得植物單細胞RNA-seq必須先消化細胞壁并制備原生質體。而原生質體的制備對于許多組織都非常困難，且制備過程會影響細胞的轉錄狀態而引入不必要的干擾。因此，一種無需原生質體化的方法對于單細胞測序技術在植物領域中更廣泛的應用必不可少。
2021年2月19日，南方科技大學生物系副教授翟繼先團隊在Genome biology雜志上發表了文章FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants，開發了一種不經過原生質體直接檢測植物單細胞核全長轉錄組測序方法。
圖片圖1. FlsnRNA-seq流程圖。首先，通過研磨的方法從組織樣本中分離出細胞核，通過10x Genomics建庫方案構建RNA文庫，獲得全長cDNA并進行擴增后，將DNA分成兩半。一半用于常規的二代文庫構建并Illumina測序，另一半用于Nanopore長片段測序。
根據翟繼先課題組之前對新生RNA全基因組水平的研究發現，細胞核中有大量已經多聚腺苷酸化的信使RNA依然與染色質相結合。那么細胞核中的RNA能否表征整個細胞的轉錄狀態呢？此外，基于Illumina平臺的二代單細胞測序往往只能捕獲基因的表達豐度，那么與全長轉錄組測序技術相結合的單細胞全長測序能否利用RNA剪接、可變多聚腺苷酸化等導致的同源異構體信息來輔助細胞類型鑒定并挖掘出更多信息呢？
為了回答這些問題，并突破原生質體的限制，優化植物單細胞測序技術，翟繼先團隊提出了基于細胞核測序的全長單細胞轉錄組測序方法FlsnRNA-seq（protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants）。此方法通過結合10x Genomics單細胞測序技術和三代全長Nanopore測序方法實現了單細胞核全長轉錄組測序。同時利用Illumina測序技術捕獲表達豐度信息，并以Nanopore測序技術捕獲同源異構體信息，從而最大限度地保留單個細胞核的轉錄狀態（圖1）。
首先，作者分離了擬南芥根尖細胞核并驗證了FlsnRNA-seq方法的有效性。二代測序方法得到的基因表達豐度信息可將捕獲到的細胞核分為14個細胞簇。利用組織特異基因對這些細胞簇進行注釋，鑒定到了10種主要細胞類型。將FlsnRNA-seq單核測序結果與已發表的單原生質體測序結果相比較發現，兩種方法所獲得的結果相似，說明植物細胞核可以取代原生質體進行單細胞轉錄組分析。此外，Nanopore文庫所捕獲的基因表達豐度矩陣與Illumina文庫高度相似。將Nanopore文庫所捕獲的同源異構體信息與Illumina文庫的表達豐度信息結合，可以對細胞類型進行更細致的分類和注釋。
為了驗證FlsnRNA-seq方法的普適性，作者還對擬南芥的心形期胚乳進行了測序分析。通過細胞聚類和注釋后，鑒定到了6個細胞簇，涵蓋了前人報道過的所有胚乳細胞類型。此外，通過分析Nanopore數據發現，在以珠孔端胚乳為主的細胞簇中，mRNA的未剪接比例明顯高于其它細胞類型，說明借助全長單細胞技術可以得到傳統二代方法難以捕獲的細胞基因轉錄和剪接信息。該方法極大拓展了植物單細胞RNA-seq的使用，從而使得植物中大規模地應用單細胞測序技術成為可能。
翟繼先教授為該論文的通訊作者，南科大為唯一通訊單位。翟繼先課題組研究助理教授龍艷萍博士、博士生劉智劍和研究助理教授賈津布博士為該論文共同第一作者，南科大生科院陳煒教授和研究副教授方亮博士也合作參與了該研究工作。