2.2 糖基化
糖 基 化 是 一 種 常 見 的 P T M , 并 且 已 經 證 明 能 夠 影 響 酶 的 活 性 、蛋 白 質 定 位 、穩 定 性 、信 號 轉 導 、細 胞 黏 附 和 蛋 白 質 相 互 作 用 (Spiro, 2002k 目 前 已 經 發 現 在 腫 瘤 惡 性 轉 化 和腫 瘤 發 生 時 ，生 物 體 液 中 蛋 白 質 和 細 胞 表 面 的 糖 基 化 模 式 會 發 生 變 化 (Durand and Seta,2000)。一 個 蛋 白 質 組 中 存 在 著 大 量 糖 基 化 修 飾 。O- 糖 基 化 蛋 白 質 是 在 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸位 點 發 生 修 飾 , 而 C -糖 基 化 則 靶 向 于 色 氨 酸 ,N-糖 基 化 靶 向 天 冬 酰 胺 。發 生 N -糖 基 化 的蛋 白 質 會 有 一 些 共 同 之 處 ，如 核 心 結 構 、一 些 去 除 N 聯 結 構 的 酶 ，并 且 普 遍 分 布 在 細 胞 膜胞 外 區域（Medzihradszky, 2005 ) 。 N-糖 基 化 位 點 有 一 個 確 定 的 共 有 序 列（consensussequence) ,即N-X-S/T ,X 是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(Pless and Lennarz, 1977)。另— 個 靶 向 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸 殘 基 的 修 飾 是 O聯β-N-乙 酰 葡 糖 胺 (O G k N A c ) 。 Gerald Hart和 同 事 開 創 了 這 種 動 態 核 質（nucleocytoplasmic) P T M 研 究 的 先 河（Holt and Hart,1986)。發 生 這 種 修 飾 的 許 多 靶 向 蛋 白 質 也 能 夠 發 生 磷 酸 化 修 飾 ，推 測 這 種 修 飾 對 蛋 白質 磷 酸 化 修 飾 會 有 拮 抗 作 用 ( A h m a d et aL , 2006)。
質 譜 鑒 定 磷 酸 化 的 一 些 問 題 同 樣 也 出 現 在 糖 基 化 研 究 中 。相 對 未 被 修 飾 的 蛋 白 質 ，這 些 修 飾 在 豐 度 上 都 傾 向 于 亞 化 學 計 量 。蛋 白 質 糖 基 化 和 O G l c N A c 修 飾 在 質 譜 中 都 是不 穩 定 的 ，通 常 產 生 低 質 量 的 測 序 譜 圖 。盡 管 N -糖 基 化 的 一 種 共 有 序 列 已 經 非 常 明 確 ，然 而 在 體 內 僅 有 部 分 含 有 這 一 共 有 序 列 的 蛋 白 質 發 生 了 糖 基 化 。
上 面 提 到 的 可 應 用 于 磷 酸 化 分 析 的 替 代 的 肽 段 斷 裂 方 法 同 樣 適 用 于 糖 基 化 。能夠解決 糖 基 化 低 豐 度 問 題 的 富 集 技 術 也 已 存 在 (Mechref e t a L ，2008)。使 用 凝 集 素 親 和 層 析(lectin affinity chromatography) 可 選 擇 性 地 富 集 糖 蛋 白 。凝 集 素 是 一 種 高 度 特 異 的 糖 結合 蛋 白 ，并 能 夠 與 固 相 基 質 偶 聯 . 偶 聯 好 的 樹 脂 與 復 雜 的 水 解 蛋 白 質 混 合 物 混 合 ，通 過 洗滌 、洗 脫 即 可 分 離 到 適 用 于 蛋 白 質 組 學 分 析 的 糖 肽 組 分 。 O G l c N A c 可 用 P-消 除 法 及 后續 的 Michael加 成 二 硫 蘇 糖 醇 或 生 物 素 -戊 胺 (biotin pentylamine)反 應 來 富 集 ，這 種 方 法類 似 于 前 文 磷 酸 化 中 所 詳 述 的 內 容 (Wells et al. ，2002)。另 一 種 方 法 是 N -聯 糖 肽 固 相提 取 法（solid-phase extraction of N-Iinked glycopeptides，S P E G ), 這 種 方 法 使 用 肼 化 學法 (hydrazine chemistry)直 接 將 糖 肽 添 加 到 固 相 支 架 上 (Tian et al. ，2007)。洗 漆 后 ，用肽 -N -糖 苷 酶 (peptide-iV-glycosidase)處 理 來 洗 脫 糖 肽 。凝 集 素 親 和 層 析 色 譜 法 的 優 點 在于 ，能 夠 結 合 的 糖 蛋 白 范 圍 非 常 廣 , 通 過 不 同 糖 苷 酶 洗 脫 能 夠 有 效 分 離 不 同 類 型 的 糖 肽(Yang and H a n c o c k , 2005)。也 有 專 門 的 柱 子 ，所包含 的 凝 集 素 特 異 地 結 合 一 定 類 型 的糖 連 接 結 構 ，能 提 供 更 高 不 同 程 度 的 選 擇 性 富 集（Tian et al. , 2007)。需 要 說 明 的 是 , 使用 糖 苷 酶 詵 脫 糖 肽 是 從 肽 段 上 切 下 寡 糖 ，這 使 得 原 本 可 以 通 過 質 譜 獲 得 的 結 構 信 息 丟 失 。但 是 這 卻 大 大 簡 化 了 數 據 分 析 過 程 , 因 為 糖 基 化 的 天 然 結 構 非 常 復 雜 ，并 且 以 多 變 的 聚 糖基 化 (polyglycosylated)形 式 存 在 。
2.3 泛素化和蘇素化修飾
泛 素 是 一 個 由 7 6 個 氨 基 酸 組 成 的 蛋 白 質 ，能 夠 通 過 其 C 端 的 甘 氨 酸 殘 基 結 合 于 底物 賴 氨 酸 的 α氨 基 基 團 。這 個 過 程 需 要 E 1 、E 2 、E 3 酶 共 同 參 與（Fang and W e i s s m a n ,2004)。泛 素 的 序 列 含 有 7 個 賴 氨 酸 , 這 7 個 賴 氨 酸 能 夠 被 泛 素 化 選 擇 ，從 而 形 成 泛 素 鏈(Fang and W e i s s m a n ，2004)。被 進 一 步 泛 素 化 的 泛 素 分 子 內 部 的 賴 氨 酸 能 夠 決 定 泛 素化 修 飾 的 生 物 學 意 義 。例 如 ，K 4 8 連 接 的 泛 素 鏈 能 引 導 被 修 飾 蛋 白 質 經 由 26S 蛋 白 酶 體降 解 , 而 K 6 3 的 連 接 形 式 則 參 與 到 D N A 損 傷 反 應 、蛋 白 質 運 輸 、N F -KB 信 號 通 路 的 信 號轉 導 等 過 程 (Ikeda and Dikic，2008; Pickart and F u s h m a n ，2004)。泛 素 化 蛋 白 的 周 轉 非常 迅 速 ，這 導 致 這 種 P T M 處 于 低 穩 態 水 平 (Peng etal. ，2003)。而 使 泛 素 化 位 點 的 預 測更 加 復 雜 化 的 是 , 幾 乎 沒 有 數 據 能 夠 證 明 泛 素 化 存 在 一 個 通 用 基 序 (SUter etal. , 2008)。
另 一 個 類 似 泛 素 的 小 蛋 白 質 分 子 就 是 蘇 素 化 修 飾 蛋 白（S U M O ) 。盡 管 兩 種 蛋 白 質一 致 性 僅 1 8 % , 但 是 它 們 的 三 維 結 構 卻 有 相 似 性 (Bayer et al. ，1998)。蘇 素 化 修 飾 和 泛素 化 共 享 相 同 的 E 1 、E 2 、E 3 酶 , 將 S U M O 分 子 結 合 到 一 個 保 守 基 序 內 部 的 氨 基 酸 殘 基上 。蘇 素 化 修 飾 優 先 發 生 在 女 K -X -E 序 列 中 ，^ 代 表 一 個 疏 水 性 氨 基 酸（Rodriguez etal. ，2001)。蘇 素 化 修 飾 靶 向 于 大 量 參 與 各 種 不 同 細 胞 進 程 的 蛋 白 質 , 如 轉 錄 調 節 、核 小體 形 成 、細 胞 核 孔 復 合 物 和 D N A 修 復 (Melchior et a L ，2003)。蘇 素 化 修 飾 能 夠 與 泛 素化 競 爭 ，從 而 阻 止 蛋 白 質 被 降 解 , 穩 定 細 胞 所 需 的 關 鍵 的 酶 。這 種 修 飾 還 能 夠 將 蛋 白 質 進行 特 定 的 細 胞 定 位 , 如 核 孔 復 合 體 (M anza et al. ，2004)。
目 前 已 經 發 展 了 一 些 有 效 的 富 集 方 法 來 分 離 泛 素 化 和 其 他 蘇 素 化 修 飾 的 蛋 白 質 。其中 最 成 功 的 一 種 是 在 泛 素 及 類 泛 素 分 子 的 基 因 序 列 中 整 合 人 氨 基 末 端 表 位 標 簽（aminoterminal epitope t a g K P e n g et al. ， 2003; Tagwerker et al. ， 2006)。 目 前 已 成 功 使 用 了多 組 氨 酸 標 簽 ，以 及 由 多 組 氨 酸 標 簽 和 F L A G 標 簽 組 成 的 串 聯 親 和 標 簽 (C h a n g , 2006)。串 聯 親 和 標 簽 純 化 方 法 能 夠 減 少 假 陽 性 的 出 現 率 ，但 是 無 法 完 全 消 除 。使 用 抗 泛 素 類 分子 的 抗 體 是 一 種 選 擇 , 但 是 這 種 抗 體 應 用 于 免 疫 沉 淀 中 以 分 離 泛 素 蛋 白 質 的 方 法 仍 在 發展 中 。也 可 利 用 泛 素 結 合 蛋 白 質 以 避 免 一 些 由 抗 體 和 親 和 標 簽 引 起 的 問 題 (Kirkpatricketal. ，2005)。表 位 標 簽 在 簡 單 模 式 系 統 ，如 釀 酒 酵 母 (Sacc/iarom^ ycescereTO’ h a e ) 中應用非 常 方 便 ，因 為 編 碼 未 標 簽 泛 素 的 多 個 基 因 可 被 刪 除 ，使 得 細 胞 中 僅 有 含 表 位 標 簽 的 泛 素分 子 。
事 實 上 ，泛 素 化 和 蘇 素 化 修 飾 都 是 蛋 白 質 類 P T M , 可 采 用 多 種 質 譜 的 手 段 鑒 定 靶 蛋白 。當 胰 酶 消 化 泛 素 化 蛋 白 質 時 ，部 分 泛 素 分 子 被 切 割 下 來 。剩下胰 蛋 白 酶 消 化 片 段 的泛 素 化 位 點 上 含 有 2 個 甘 氨 酸 殘 基 ，通 過 一 個 異 肽 鍵 與 賴 氨 酸 相 連（P eng et a L ，2003)。這 一 肽 段 導 致 在 賴 氨 酸 殘 基 處 產 生 了 一 個 114 D a 的 標 稱 質 量 漂 移 ，而 且 由 于 胰 蛋 白 酶 不能 識 別 修 飾 過 的 賴 氨 酸 ，因 而 還 丟 失 了 一 個 胰 蛋 白 酶 酶 切 位 點 。對 于 其 他 蘇 素 化 修 飾 也有 各 自 特 征 性 的 質 量 漂 移 , 見 表 40. 2(D enis〇n et al. ， 2005)。當 搜 索 譜 圖 尋 找 該 類 型 的潛 在 P T M 時 ，可 以 考 慮 這 些 特 性 。
使 用 基 于 質 譜 的 蛋 白 質 組 學 方 法 研 究 此 類 P T M 的 一 個 顯 而 易 見 的 問 題 就 是 質 量 S移 (mass shift) 的 冗 余 ，如 表 40. 2 所 示 。從 一 個 肽 的 鑒 定 譜 圖 中 可 能 無 法 分 辨 這 是 泛 素化 修 飾 還 是 蘇 素 化 修 飾 ，因 為 這 兩 種 類 型 都 能 在 賴 氨 酸 殘 基 處 增 加 114 D a 。蘇 素 化 修 飾會 使 肽 段 質 量 增 加 較 大 ，這 會 影 響 肽 段 的 電 離 ，減 弱 電 離 效 率 。發 生 蘇 素 化 修 飾 肽 段 會 使結 果 譜 圖 變 復 雜 ，甚 至 無 法 解 讀 。 一 個 實 驗 室 發 展 了 蘇 素 化 修 飾 模 式 識 別 軟 件（S U M -m 〇n ) ，來 尋 找 由 復 雜 P T M 產 生 的 碎 片 離 子 模 式 ，并 鑒 定 修 飾 肽 段 及 其 相 應 的 修 飾 位 點