聚丙烯酰胺凝膠中DNA片段的回收（壓碎與浸泡法）

DNA 標準參照物 DNA 樣品

丙烯酰胺凝膠洗脫緩沖液 氯仿 乙醇 凝膠載樣緩沖液 酚 氯仿 乙酸鈉 TE

聚丙烯酰胺凝膠 一次性使用的塑料層析柱 轉輪或旋轉平臺 紫外燈

一、材料

1. 緩沖液和溶液

丙烯酰胺凝膠洗脫緩沖液（0.5 mol/L 乙酸鎂，10 mmol/L 四水乙酸鎂，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.1%（m/V）SDS（可選或不選））

氯仿

乙醇

6X 凝膠載樣緩沖液

酚：氯仿（1:1, V/V）

乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2)

TE (pH 8.0)

2. 凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

適宜濃度的聚丙烯酰胺凝膠和高分辨率瓊脂糖凝膠

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 標準參照物，由限制酶消化已知量的 DNA 樣品得到

DNA 樣品

4. 專用設備

一次性使用的塑料層析柱（如 Quik-Sep 柱，Isolabs，Inc.) 或裝有 Whatman GF/C 濾紙致密硅化玻璃棉的注射器針筒

轉輪或旋轉平臺，置于 37℃ 溫箱中

手提式長波（302 nm) 紫外燈

二、方法

1. 按照方案 “中性聚丙烯酰胺凝膠電泳” 的方法，進行 DNA 樣品和標準參照物的聚丙烯酰胺凝膠電泳。用放射自顯影或長波紫外燈（302 nm) 檢測溴化乙錠或 SYBR Gold 染色的凝膠, 以確定目的 DNA 的位置。

2. 用干凈、鋒利的解剖刀或剃須刀片切下含有目的條帶的凝膠，要使切下的聚丙烯酰胺凝膠條盡可能小。可按如下方法中的任何一個操作：

(1) 在紫外燈照射下，將凝膠與 Saran Wrap 膜一同切下，然后從膜上剝下凝膠條。

(2) 紫外燈從下面照射凝膠，用永不褪色的標記筆（如 Sharpie 筆）在玻璃板的背面勾勒出 DNA 條帶的位置。翻轉凝膠，揭去 Saran Wrap 膜，按照標記筆作的標記切下 DNA 條帶。

(3) 當用放射自顯影檢測時，將曝光后的放射自顯影膠片放在 Saran Wrap 膜上，并與凝膠比齊。用標記筆在玻璃板的背面勾勒出所需 DNA 片段的位置。移去膠片和 Saran Wrap 膜，切下該條帶。

3. 將切下的凝膠條移入微量離心管或聚丙烯管中，用一次性吸頭或接種針對著管壁將凝膠擠碎。

或者，用干凈的解剖刀或剃須刀先將凝膠切成小條再放入洗脫管中。

4. 估計出凝膠條的大致體積，向微量離心管中加入 1~2 倍體積的丙烯酰胺凝膠洗脫緩沖液。

5. 蓋上離心管蓋，在轉輪或旋轉平臺上 37℃ 溫育。

6. 樣品在臺式離心機中以最大轉速于 4℃ 離心 1 min。將上清移入另一新的離心管中，應特別小心，不要將聚丙烯酰胺凝膠塊轉移進去（使用一根拉長的巴斯德吸管效果甚佳)。

7. 向聚丙烯酸胺沉淀物中再加入 0.5 倍體積丙烯酰胺凝膠洗脫緩沖液。混旋片刻，再次離心。合并兩次上清液。

8. (可做可不做）上清液通過一次性使用的塑料層析柱（如Isolabs, Inc., Quick-Sep 柱）或裝有 Whatman GF/C 濾膜或充填硅化玻璃棉的注射器針筒，以去除殘留的聚丙烯酰胺膠塊。

9. 將 2 倍體積 4℃ 的乙醇加到穿過液中，冰上放置 30 min。在臺式離心機中以最大轉速于 4℃ 離心 10 min，回收 DNA。

10. 用 200 μl TE ( pH 8.0) 溶解 DNA, 再加入 25 μl 3 mol/L 乙酸鈉溶液（pH 5.2), 然后按步驟 9 的方法用 2 倍體積的乙醇再次沉淀 DNA。

11. 用 70% 乙醇小心洗滌 DNA 沉淀。TE ( pH 8.0 ) 重溶 DNA 至終體積 10 μl。

12. 通過聚丙烯酰胺或高分辨率瓊脂糖凝膠電泳對 DNA 進行定性和定量。

(1) 將少量最終制備得到的 DNA 片段（約 20 ng）與 10 μl TE ( pH 8.0) 混合，加入 2 μl 所需的凝膠載樣緩沖液。

(2) 在適當濃度的聚丙烯酰胺或高分辨率瓊脂糖凝膠上樣并電泳，用已知的內切酶消化產物作為分子質量標記。分離的片段應和分子質量標記中相同大小的片段同步遷移。

(3) 仔細檢査凝膠是否存在 DNA 污染的弱熒光條帶。常常可以比較目的條帶和分子質量標記條帶的相對熒光強度估計 DNA 量。