聚乙二醇沉淀法純化質粒DNA實驗

粗制質粒

氯仿 乙醇 異丙醇 LiCl PEG-MgCI2 酚 氯仿 乙酸鈉 TE

Sorvall SS-34 或與其相當的轉頭 冰水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

(1) 氯仿

(2) 乙醇

(3) 異丙醇

(4) LiCl ( 5 mol/L)

(5) PEG-MgCI₂ 溶液

(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）

(7) 乙酸鈉（3 mol/L, pH 5.2 )

(8) TE ( pH 8.0 )

(9) TE ( pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A

2. 核酸和寡核苷酸

粗制質粒

3. 離心機和轉頭

Sorvall SS-34 或與其相當的轉頭

4. 專用設備

冰水浴

二、方法

1. 將 3 ml 粗制質粒轉移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷卻至 0℃。

2. 加入 3 ml 冰預冷的 5 mol/L LiCl，混勻，于 4℃ 離心 12000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，10000 r/min ) 10 min。

3. 轉移上清至 30 ml Corex 管中，加等體積異丙醇，混勻，室溫離心回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 轉頭，10000 r/min ) 10 min。

4. 小心倒去上清，倒置管口，使液體流干。室溫下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁。小心將乙醇倒去，用真空抽吸器將管壁上殘留的乙醇抽干。在紙巾上倒置數分鐘，使無可見乙醇殘留。但應使沉淀保持濕潤。

5. 用 500 μl 含 RNase A 的 TE ( pH8.0 ) 溶解濕潤的核酸沉淀。將溶液轉移到微量離心管，室溫放置 30 min。

6. 將質粒-RNase 混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。

7. 用標準的乙醇沉淀法回收 DNA。

8. 將質粒 DNA 沉淀用 1 ml 滅菌水溶解，再加入 0.5 ml PEG-MgCl₂ 溶液。

9. 室溫放置超過 10 min，然后于室溫用微量離心機在最大速度離心 20 min, 以回收沉淀的質粒 DNA。

10. 沉淀用 0.5 ml 70% 乙醇重懸以去除微量 PEG, 用微量離心機在最大速度離心 5 min 以回收核酸。

11. 吸去乙醇，重復步驟10。第二次洗滌后，在離心管架上放置 10~20 min, 使乙醇揮發。

12. 濕潤的質粒沉淀用 500 μl TE ( pH 8.0 ) 溶解。以 1:100 用 TE ( pH8.0）稀釋后測 OD₂₆₀ 并計算質粒 DNA 的濃度。按 1OD₂₆₀ =50μg 質粒 DNA/ml 計算。

13. 分裝 DNA 并保存于 -20℃。