聚乙二醇200基硝苯柳胺與鑰孔戚血藍蛋白的相互作用

吳勇權, 郭　維, 許麗榮, 唐彪生, 趙嬌嬌, 鄭綠茵, 范小林3
(贛南師范學院,江西省有機藥物化學重點實驗室,江西贛州341000)
摘　要:采用熒光光譜、紫外吸收光譜和圓二色譜(CD) 研究了聚乙二醇200 基硝苯柳胺與鑰孔戚血藍蛋白( KL H) 的相互作用。結果表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺對KL H 的熒光猝滅機制屬于靜態猝滅;由Lineweaver2Burk 方程計算出不同溫度下結合常數K ,由Van’t Hoff 方程計算出△H 和△S 平均值,結合力主要為靜電作用力;根據Fêrster非輻射能量轉移機制求得給體與受體間的結合距離r = 5. 76 nm ;同步熒光光譜表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺能夠被KL H 存儲和轉運,但結合時對蛋白的構象有一定的影響;圓二色光譜的數據表明相互作用后KL H 的二級結構發生了改變: KL H的α2螺旋的含量從43. 1 %下降到37. 8 %。
關鍵詞:硝苯柳胺;鑰孔戚血藍蛋白;熒光光譜;紫外吸收光譜;圓二色譜
中圖分類號:O657. 3 　　文獻標識碼:A 　　　文章編號:100626144 (2010) 0120011204
硝苯柳胺是一種重要的殺蚴劑,對尾蚴也有一定的殺滅作用,在預防日本血吸蟲病中有重要作用[122 ] 。由于硝苯柳胺難溶于水,難以直接作為殺蚴劑使用。為增強其水溶性,在硝苯柳胺分子的羥基上連接聚乙二醇200 非離子型表面活性基團,發現改性后的聚乙二醇200 基硝苯柳胺具有良好的殺蚴作用。血藍蛋白又稱血清素,在生物體內的生理功能相當于血紅蛋白,是一種重要的氧載體[3 ] 。釘螺是軟體動物門腹足綱中重要的螺類動物,釘螺的血液中含有的呼吸色素主要是血藍蛋白。采用熒光光譜法研究聚乙二醇200 基硝苯柳胺與鑰孔戚血藍蛋白( KL H) 的相互作用目前尚未見相關報道。
本文研究了聚乙二醇200 基硝苯柳胺與KL H 作用的熒光猝滅機理,通過熱力學參數討論了作用力類型,用同步熒光光譜考察了聚乙二醇200 基硝苯柳胺對KL H 構象的影響,采用圓二色譜(CD) 證實其構象發生變化。該研究為進一步了解聚乙二醇200 基硝苯柳胺滅釘螺機理提供一定幫助。
1 　實驗部分
1. 1 　儀器和試劑
LS255 型熒光光譜儀(美國, Perkin2Elmer 公司) ;Cintra 10 型紫外可見分光光度計(澳大利亞, GBC公司) ;J2810 型圓二色分光光度計(日本,J asco公司) ;Millipore 超純水系統。聚乙二醇200 基硝苯柳胺按照文獻[ 4 ]方法合成,并配制成1. 0 ×10 - 3 mol/ L 的儲備液備用; KL H(購于Sigma2Aldrich 公司) 配制成1. 0 ×10 - 6 mol/ L 儲備溶液,并于冰箱中(溫度于0～5 ℃) 保存,其余試劑均為分析純。
1. 2 　實驗方法
1. 2. 1 　熒光光譜與紫外吸收光譜的測定　
準確移取2. 5 mL 1. 0 ×10 - 6 mol/ L 的KL H 溶液于1 cm 的石英比色皿中,置恒溫水浴鍋中,用微量進樣器逐次加入濃度為1. 0 ×10 - 3 mol/ L 的聚乙二醇200 基硝苯柳胺甲醇溶液進行滴定,滴定時每次加入體積為5μL ,滴定劑累加體積小于90μL ,因此可忽略體積效應。每次滴定完攪拌均勻,恒溫5 min (298 K,310 K,320 K) 后,以λex = 280 nm ,測定300～445 nm 的熒光發射光譜,記錄KL H 的熒光光譜及藥物對KL H 的熒光猝滅光譜。固定激發和發射波長間隔△λ分別為15nm 和60 nm ,記錄同步熒光光譜。測定聚乙二醇200 基硝苯柳胺(1. 0 ×10 - 6 mol/ L) 的甲醇溶液在300～445 nm 處的紫外吸收光譜,以無水甲醇溶液作空白對照。
1. 2. 2 　圓二色譜的測定　
實驗時光源系統用氮氣保護(流量為10 L/ min) ,樣品池的光徑為0. 2 cm。測量參數:掃描速率100 nm/ min 。分辨率0. 1 nm ,響應時間1 s ,累積次數3 次。掃描波段為200～240 nm。KL H 濃度為2. 00 ×10 - 7 mol/ L 。向上述指定濃度KL H 中加入藥物,控制藥物與KL H 物質的量之比,測其CD 譜,并用儀器附帶的楊氏法計算出二級結構單元的相對含量。
2 　結果與討論
2. 1 　熒光光譜
由圖1 可知,聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KHL 的熒光發生猝滅,且隨藥物濃度的增加KHL 熒光強度逐步降低。
這表明兩者之間存在著相互作用,且隨聚乙二醇200 基硝苯柳胺濃度的增加兩者的結合趨向飽和。在激發波長為280nm 時,色氨酸最大熒光發射峰在340 nm 左右[526 ] ,復合體系在340 nm 處熒光強度顯著降低,這表明藥物與KL H 結合時位于或接近于色氨酸殘基。
2. 2 　猝滅機理和猝滅速率常數
假設此熒光猝滅是動態猝滅,則熒光強度可用Stern2Volmer 方程F0 / F = 1 + Kqτ0 [Q ] = 1 + KSV [Q ] 處理[7 ] ,以F0 / F 對[ Q ] 作Stern2Volmer 圖, 作Stern2Volmer 曲線擬合,得出298 K、310 K、320 K時雙分子猝滅過程速率常數分別為3. 73 ×1012 、3. 12 ×1012 、2. 88 ×1012 L?mol- 1 ?s - 1 ,均大于猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(2. 0 ×1010L?mol- 1 ?s - 1 ) ,由此說明熒光猝滅不是動態雙分子猝滅過程,而是由于聚乙二醇200 基硝苯柳胺與KL H結合形成了復合物引起的靜態猝滅。
2. 3 　結合常數K
在靜態猝滅中,結合常數K 與熒光強度、猝滅劑濃度之間的關系可以用Lineweaver2Burk 雙倒數函數表示[8 ] : ( F0 - F) - 1 = F - 10 + K- 1 F - 10 [Q ]- 1 ,以( F0 - F) - 1對[Q ] - 1作雙倒數圖,求得聚乙二醇200 基硝苯柳胺與KL H 在298 K、310 K、320 K的結合常數分別為3. 78 ×104 、3. 12 ×104 、2. 51 ×104 L?mol- 1 , K值均為104 數量級,表明它們之間的結合力較強。此外,結合常數隨溫度升高而減小,進一步說明藥物對KL H 的內源熒光猝滅過程主要為靜態猝滅。
2. 4 　熱力學參數和作用力類型
根據反應前后的焓變△H 和熵變△S 的相對大小,可以判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型。
根據聚乙二醇200 基硝苯柳胺與KL H 的結合常數K ,并結合熱力學方程求出不同溫度下反應的△G、△H 和△S ,把得到的數據列于表1 中。從表1 中的數據可以看出: △H < 0 , △S > 0 ,所以聚乙二醇200基硝苯柳胺與KL H 之間的作用力主要為靜電引力[9 ] 。但在許多情況下,有機小分子與蛋白的反應是多種力協同作用的結果,聚乙二醇200 基硝苯柳胺分子母核有較強的疏水作用,因此疏水作用力也可能參與了藥物與KL H 間的作用過程。從熱力學角度來看,在一定溫度和壓力下,藥物與KL H 的結合反應能否自發進行取決于△G, △G< 0 時則有利于反應的自發進行。從表1 可以看出△G< 0 ,所以藥物與KL H 之間的結合是自發進行的。
2. 5 　結合距離的計算
根據Fêrster的非輻射能量轉移理論[10 ] ,在25 ℃時做出聚乙二醇200 基硝苯柳胺的紫外2可見吸收光譜和KL H 的熒光光譜,兩光譜有一定程度的重疊(圖2) 。求得光譜的重疊積分J = 1. 36 ×10 - 14 cm3 ?L?mol- 1 ,轉移效率為50 %時的臨界距離R0 = 3. 80 nm 和轉移效率E = 0. 076 ,進而求出給體2受體間距離r = 5. 76 nm , r < 7 nm ,從而說明聚乙二醇200 基硝苯柳胺與KL H 結合時是通過非輻射能量轉移機制導致蛋白質的熒光發生猝滅的[11 ] 。
2. 6 　聚乙二醇200 基硝苯柳胺對KLH構象的影響
在△λ= 15 nm 和△λ= 60 nm 時,分別向KL H 溶液中逐漸增加聚乙二醇200 基硝苯柳胺的濃度(圖3) 。隨著藥物的濃度逐漸增加,色氨酸殘基的最大發射波長沒有明顯改變,而酪氨酸殘基的最大發射波長緩慢地減小,說明聚乙二醇200基硝苯柳胺的加入對使酪氨酸殘基周圍的疏水性增加[12213 ] 。
這說明聚乙二醇200 基硝苯柳胺在釘螺體內能夠被血藍蛋白存儲和轉運時對蛋白構象有一定影響。
通過圓二色(CD) 譜可以靈敏地檢測一些反應引起的蛋白分子的二級結構變化[14 ] 。如圖4 所示, KL H 在209 nm 和221 nm 左右表現出兩個負的吸收峰,主要為α2螺旋結構的蛋白質[15 ] 。隨著聚乙二醇200 基硝苯柳胺濃度的增加,KL H 在209 nm 和221 nm 左右處兩個負吸收峰的強度減小,但形狀和肩峰的位置未發生明顯改變,表明聚乙二醇200 基硝苯柳胺使KL H 中的α2螺旋的含量降低。通過CD 譜儀二級結構分析軟件計算,α2螺旋的含量由42. 1 %下降到34.7 %,β2折疊含量由10. 2 %變為9. 1 %,而β2轉角的含量由22. 8 %變為26. 9 %。以上結果表明,聚乙二醇200 基硝苯柳胺誘導KL H 發生了二級結構改變,這是導致KL H 內源性熒光猝滅的原因。
參考文獻:
[1 ] YI J ian2min (易健民) ,SHI Tian2yi (施天益) , YAN J ian2hui (閻建輝) ,L IAO De2zhong (廖德仲) ,L I Xiang2hua (李香華) ,XU You (許　友) ,ZHON G Ming (鐘　明) . Journal of Nanhuan University(南華大學學報) [J ] ,2001 ,15 (4) :22.
[2 ] CHEN Sheng2tian (陳生田) ,ZHU J in2hua (朱金華) ,LON G Cai2yun (龍彩云) . Practical Preventive Medicine (實用預防醫學) [J ] ,2004 ,11 (5) :879.
[3 ] ZHAN G Yue2ling (章躍陵) ,LUO Yun (羅蕓) ,PEN G Xuan2xian (彭宣憲) . Marine Sciences (海洋科學) [J ] ,2007 ,31(2) :77.
[4 ]Guo W ,Zheng L Y,Wu Y Q ,Fan X L. Chin. Chem. Lett . [J ] ,2008 ,19 :406.
[5 ] Sulkowsak A ,Równicka J ,Bojko B. J . Mol. St ruct . [J ] ,2003 ,651～653 :133.
[6 ] L IU J ia2qin (劉家琴) , TIAN J ian2niao (田建裊) ,BIAN Qing2quan (邊清泉) , HU Zhi2de (胡之德) . Spectroscopy andSpectral Analysis (光譜學與光譜分析) [J ] ,2006 ,26 (4) :716.
[7 ] CHEN Guo2zhen (陳國珍) ,HUAN G Xian2zhi (黃賢智) ,ZHEN G Zhu2zi (鄭朱梓) . Methods of Fluorescence Analysis(熒光分析法) [M] . Beijing (北京) :Science Press (科學出版社) ,1990 ,112.
[8 ] XIE M X ,LON G M ,L IU Y. Biochim. Biophys.Acta[J ] ,2006 ,1760 :1184.
[9 ] MA Jing (馬靜) ,ZHENG Xue2fang (鄭學仿) , TAN G Qian (唐乾) , YAN G Yan2jie (楊彥杰) ,SUN Xia (孫霞) ,GAO Da2bin (高大彬) . Chem. J . Chinese Universities (高等學校化學學報) [J ] ,2008 ,29 (2) :260.
[10 ] BAI Hai2xin (白海鑫) ,YAN G Cheng (楊　成) , YAN G Xiu2rong (楊秀榮) . Chem. J . Chinese Universities (高等學校化學學報) [J ] ,2007 ,28 (2) :227.
[11 ] MA Xu2wen (馬旭文) ,L I Zhong2ping (李忠平) ,L I J ian2qing (李建晴) ,DONG Chuan (董川) . Journal of AnalyticalScience (分析科學學報) [J ] ,2008 ,24 (4) :399.
[12 ] Il’ichev Y V ,Perry J L ,Simon J D. J . Phys. Chem. B[J ] ,2002 ,106 :452.
[13 ] L IU Gen2lan (劉根蘭) ,NI Yong2nian (倪永年) . Chem. J . Chinese Universities (高等學校化學學報) [J ] ,2008 ,29 (7) :1342.
[14 ] Haron M K,Thomas J J ,Nicholas C P. Biochimica et BiophysicaActa[J ] ,2005 ,1751 :119.
[15 ]Dockal M ,Carter D C ,Ruker F. J . Biol. Chem. [J ] ,2000 ,275 (5) :3042.
Interaction of Keyhole Limpet Hemocyanin with
PEG2002niphensamide
WU Yong2quan , GUO Wei , XU Li2rong , TAN G Biao2sheng ,
ZHAO J iao2jiao , ZHEN G Lu2
yin , FAN Xiao2lin 3
( Key L aboratory of Organo2p harmaceutical Chemist ry of J i an g x i Province , Gannan N ormal
Universi t y ,Ganzhou341000)
Abstract :The interaction of keyhole limpet hemocyanin ( KL H ) and PEG2002nip hensamide was
investigated by fluorescence spectroscopy , ultraviolet absorption spectroscopy and circular dichroism(CD) spectroscopy. It was shown that KL H fluorescence at 340 nm was quenched regularly wit h theaddition of PEG2002nip hensamide ; t he quenching constant s were decreased with the temperatureincreasing ; and the quenching was verified as static fluorescence quenching. The binding constant s ( K)were obtained according to Lineweaver2Burk equation at different temperature. The calculatedthermodynamic parameter s ( △H , △S) according to Van’t Hoff equation indicated t hat the elect rostaticinteraction played major roles in t he binding processes. The distance between KL H and PEG2002nip hensamide was 5. 76 nm according to t he theory of the Fêrster energy t ransference. The effect s ofPEG2002nip hensamide on the conformation of KL H were f urt her analyzed by synchronous fluorescencespectroscopy and circular dichroismspectroscopy. PEG2002nip hensamide could be deposited andtransported by KL H and it affected t he conformation of KL H. The secondary structure of KL H wasaltered (CD data) , i. e. , t heα2helices were reduced f rom 43. 1 % to 37. 8 %.
Keywords :Nip hensamide ; Keyhole limpet hemocyanin ; Fluorescence spectroscopy ; Ultraviolet
spectroscopy ; Circular dichroismspectrometry