聚合酶鏈反應構建重組DNA

DNA

TE 無水乙醇 DNA聚合酶 CTP

電泳儀 離心機 PCR儀

1.  制備模板DNA，如DNA不是經氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10 min 以滅活核酸酶。

2.  制備寡核苷酸引物，若PCR產物要進行平端克隆，就應該對引物的5'端羥基進行磷酸化處理。
 

圖一、用PCR反應引入單一的酶切微點和產生符合讀碼框架的融合蛋白。

3.  建立標準的擴增反應，以礦物油覆蓋表面，在以下條件下進行20~25輪擴增循環：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min，最后一個循環在72℃延伸10 min 盡可能使擴增產物完整。
 

圖二、序貫PCR法構建重組DNA分子，引物1b與基因2同源區域；引物1c有與基因1同源區域

4.  取少量反應混合物（4~8 ul），用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增效果。

5.  吸去礦物油上層，用氯仿抽提1次除去殘存的礦物油，用飽和酚抽提1次，然后用無水乙醇沉淀DNA。
 

圖三、用反向PCR插入酶切位點
 

6.  4℃高速離心10 min，沉淀用20 ul TE緩沖液溶解。

7.  用玻璃珠，電冼脫或低融點膠的酚抽法進一步純化PCR產物可去除未摻入dNTP引物、無關的PCR產物和模板DNA。

8.  對于通過平端連接進行的克隆：用DNA聚合酶I （或klenow酶）修平擴增片段的3'末端。

9.  對于通過粘端連接進行的克隆：在20 ul 體積用合適的酶消化一半PCR只產物，用過量的酶消化數小時。

10.  用合適的末端互補的酶在20 ul 體積內消化0.2~2 ug 載體DNA，用CIP去瞵酸化，以阻止載體自連。

11.  用普通瓊脂糖或低融點瓊脂溏電泳分離線性化的載體。

12.  用玻璃珠、電洗脫、或酚抽法回收線狀的載體。

13.  連接PCR片段和線狀載體。

14.  取部分連接產物轉化大楊桿菌，從轉化體集中以小量制備法提取質粒DNA。

15.  用合適的酶消化轉化體的質粒DNA，以瓊脂糖凝膠電泳分析以確證片段的插人。

16.  測定質粒DNA中擴增片段的序列，檢查有無突變，或者用生物化學或遺傳學方面的功能分祈篩選轉化體。

1. 如果出現非特異性帶，則可能：

（1）引物設計不合理，出現發夾結構或二聚體；

（2）退火溫度不合適；

（3）聚合酶質量不好；

（4）有污染；

（5）引物不純或過量；

（6）模板過量。

隨著科學技術的不斷發展，在傳統PCR技術的基礎上發展了包括逆轉錄PCR，實時定量PCR等新技術，以及多重PCR、DNAshuffing，PCR芯片，固相PCR等改良技術。目前有運用恒溫快速擴增技術作為DNA甲基化特異性檢測方法來驗證癌癥的基因，為醫學領域的深入探究提供新方法新思路。

文獻：廖萍，劉茶珍，重組酶介導擴增技術與傳統聚合酶鏈反應技術在甲狀腺癌DNA甲基化檢測中的應用對比，中國醫藥，2003,8（6）：797-799