①引物的長度一般為15-30 bp,最好在18~24 bp,因為太短易形成錯配(False priming) 降低特異性,而太長也會降低特異性,并且降低產量 。
②引物在模板內最好具有單一性,也就是說在模板內部沒有錯配。特別是3’端,一定要避免連續4個以上的堿基互補錯配。
③引物序列的GC 含量最好在40%一60%,且上下游引物序列GC含量的差異不要太大,3’端最后5個堿基最好不要富含GC,特別是連續3個的G或C。
④DNA雙鏈形成所需的自由能AG,應該以5’端向 3’端遞減,3’端AG最好不要高于9.0 keaf mol 。
⑤避免形成穩定的引物二聚體(Dimer and Cross DimeO 和發夾結構(Hairpin),AG高于4.5 keal/mol時易引發 上述兩種結構的產生。
⑥ 引物所在的模板區域應該位于外顯子區,最好跨越一個內含子區,這樣便于對擴增出來的片段進行功能鑒定和表型分析。
⑦ 如果以DNA為模板設計引物,產物長度在100—600 bp比較理想。而以mRNA為模板設計引物時,產物長度在150—300 bp比較理想。
⑧5’ 端對PCR影響不太大,可以引進修飾位點和標記物 。