腫瘤細胞的熒光免疫表型和FISH共分析實驗

實驗材料 正常鼠血清鼠單克隆抗地髙辛抗體鼠抗 FITC 抗體AMCA-親和素FITC-親和素生物素化山羊抗親和素抗體Cy3 標記的親和素Cy3 標記的山羊抗鼠抗體Cy3 標記的兔抗山羊抗體Cy3 標記的驢抗兔抗體Cy3 標記的兔抗鼠抗體 地高辛標記的山羊抗鼠抗FITC 標記的驢抗鼠抗體FITC 標記的山羊抗地高辛抗體緩沖液SSC

試劑、試劑盒 單克隆鼠抗人抗體人 Cot-1 DNA人胎盤 DNA硫酸葡聚糖Sephadex 050 分離柱超聲破碎的鮭魚精子DNA70% 、85% 和 100% 乙醇橡皮泥去離子甲酰胺DAPI (4 6-二氨基-2-苯基吲哚）DABCO (2 2 2-三乙烯-14-二胺）

實驗步驟

一、標本制備

同時進行免疫表型和 FISH，可以使用細胞離心制片、涂片、印跡或冰凍切片。適當的操作和保護細胞完整是成功完成這部分實驗的關鍵。一般來說，新鮮制備的標本片應該晾干過夜 再轉入-20°C 或一 80°C 保存。低溫下標本片可以保存數周甚至數年。自冰箱取出后，標本片應在室溫下解凍，并晾干后再使用。使用前，應該在相差顯微鏡下檢查細胞的形態和位置。下面 是細胞離心制片的制作方法。

1.將機體組織如淋巴結或實體瘤組織在 PBS 緩沖液中用剪或刀切成小塊。

2.收集得到細胞懸液。

3.200 g 離心 IOmin。

4.棄去上清，PBS 重懸細胞。

5.細胞計數。

6.調節細胞濃度至 IXlO4 個/mL。

7.取 200, 細胞懸液加入細胞離心機，200 g(800r/min) 離心 5 min。

8.晾干標本片過夜或室溫下放置至少 2 h。

9.-20℃ 保存標本片。

二、免疫表型

根據需要解決的問題，進行一兩次免疫表型實驗。下面是兩種實驗方法。

單抗原的免疫表型

在此步免疫表型結果可以在熒光顯微鏡下觀察，PN 緩沖液封片，蓋上玻璃蓋片，鏡下檢測是否有相當數量的細胞發出熒光。如果沒有，終止實驗，用不同濃度的抗體進行對照實驗。注意當標本片滴加 PN 緩沖液后細胞熒光亮度比較弱。不要長時間在鏡下觀看。

16.70%、85% 和 100% 梯度乙醇脫水，每次 3 min，晾干至少 lOmin，預備進行 FISH 實驗（見上述的 3.3)。

雙重免疫表型（如 CD4 和 CD8)

第一抗原的免疫表型

第二抗原的免疫表型

三、FISH

DNA 探針制備

多拷貝探針

許多多拷貝探針已經商品化，如 Vysis。一般實驗使用雜交 mastermixI，但是如果是商品探針，建議按照生產商的說明書進行實驗。

單拷貝或特異位點 DNA 探針

這些探針克隆在不同的載體（從噬菌體到 BAC、PAC、YAC) 上。DNA 用生物素、地高辛或突光染料標記后，探針離心縮小反應體積。雜交 mastermixII 可用來溶解探針。一些商品探針，如涂染探針，也可以用這種方法。按生產商的建議進行探針制備，例如，自 Vysis 購買的 DNA 探針，IfjtL 直接標記探針應加入 2pL 去離子水和 7pL 提供的 CEP 雜交緩沖液。

DNA 標記

我們推薦使用 LifeTechnologies/Gibco 的 DNA 缺口平移標記試劑盒結合生物素、地高辛或熒光染料，如綠色或橙色進行 DNA 標記。每次反應，IpgDNA 探針在 15°C 標記 lh。標記物經 Sephadex050 分離柱上樣后離心。1% 瓊脂糖凝膠上樣 5|uL 缺口平移標記探針，檢測探針片段的長度，長度應為 200?800bp，大部分在 300?600bp。

沉淀標記的 DNA 探針

1.向 I.5 mL Eppendorf 離心管中加入下述試劑，并在-70°C 放置 30 min:5~10ul 標記 DNA、5ug 人 Cot-1DNA、人胎盤 DNA、3ug 鮭魚精子 DNA、1/10 體積的 3mol/L NaOAc(pH5.2) 和 2.5倍體積的 100% 乙醇。

2.4°C 下 13OOOg 離心 30 min。

3.棄去上清，加入 2 倍體積的 70% 乙醇溶解剩余的鹽，13OOOg 離心 10min。

4.室溫下晾干。

5.10uL 雜交 mastermixI 或 mastermixII，混勻，溶解探針。

雜交

如果進行的是單抗原免疫表型，將進行雙色 HSH(生物素和地高辛探針）。在雙色 FISH 中，等量的地高辛和生物素探針一起沉淀，與細胞雜交。當進行的是雙重免疫表型時，只要用地高辛探針進行一次 FISH 雜交即可（見注釋 5)。

1.2~3uL 含有 DNA 探針的雜交混合物滴加到雜交區域。

2.蓋上 12 mm 蓋片。

3.橡皮泥封片，讓其干燥

4.將標本片放在鋪有濕紙巾的金屬盒底，蓋好金屬盒，將其置于 76°C 水浴中 5 min(見注釋 6)。

5.將金屬盒轉入 37°C 溫箱。根據 DNA 探針的類型，選擇雜交數小時、過夜或幾天。重復序列探針，雜交只需要 2 h，而 cDNA 探針或染色體涂染探針，雜交則需要 2 天。

雜交后洗脫

1.除去橡皮泥。

2.將標本片在預熱的 0.1XSSC 緩沖液（pH7.0,60°C) 中將蓋片輕輕地滑掉（見注釋 7)。

3.0.1XSSC 洗片 3 次，每次 5 min。

4.標本片在 PN 緩沖液中于室溫下浸泡 3 min。

雜交信號的檢測

下述實驗方法用于檢測雙色探針（生物素和地高辛）。同時進行雙重免疫表型和 FISH 時，只用地高辛探針雜交。檢測生物素探針的抗體的步驟如 AMCA-親和素和生物素標記的山羊抗親和素，可以省略（見注釋 5)。

1.將 AMC 標記的親和素和單克隆鼠抗地髙辛抗體（分別用 PNM 緩沖液 1:100 稀釋）混合物室溫下孵育 25 min。

2.用 PN 緩沖液于室溫下洗片 3 次，每次 5 min。

3.將生物素標記的羊抗親和素抗體和地高辛標記的羊抗鼠抗體（分別用 PNM 緩沖液 1:100 稀釋）混合物室溫下孵育 25 min。

4.用 PN 緩沖液于室溫下洗片 3 次，每次 51^11。

5.將 AMC 標記的親和素和 FITC 標記的羊抗地高辛抗體（分別用 PNM 緩沖液 1:100 稀釋）室溫下孵育 25 min。

6.用 PN 緩沖液于室溫下洗片 3 次，每次 5 min。

7.用抗淬滅劑封片。如果實驗中只有紅綠熒光染料，封片前應將標本片在 DAPI 溶液中染 2 min，2XSSC 漂洗。復染可以幫助確定雜交信號在細胞核中的位置。

四、圖像保存和評估免疫表型和 FISH 結果

根據使用的單色、雙色或三色熒光濾片系統，免疫表型和 FISH 結果可以同時或依次觀察。結果可以用髙速膠片（ASA400) 或數字成像系統進行拍攝。對于免疫表型的結果，分辨真假信號是很重要的。一般來說，真信號明亮新鮮，而假信號則模糊微弱或者極其的明亮。FISH 分析細胞的免疫表型，只能對完整的沒有重疊的細胞進行評估。我們一般一張標本可以分析至少 50 個陽性結果細胞和超過 1 〇〇個陰性結果細胞。比較重要的是，結果評估應該由另一個獨立的觀察者來完成。

注釋

1.免疫表型實驗中，單克隆鼠抗人 CD 抗體和多克隆 Cy3 和 AMCA 交聯抗體都用 PNM 緩沖液以 1:50?1:200 的比例稀釋。根據抗體質量和細胞中抗原表達水平確定適宜的抗體濃度。例如，在 T 淋巴細胞中高表達的 CD3 只需要與第一種或第一和第二種抗體孵育就可以輕易檢測到。應該對每種新購買的抗體進行對照實驗以確定其最適濃度。一般來說，Cy3 和 FITC 是強的可靠的染料，而 AMCA 比較弱，不穩定。Cy3 檢測免疫表型的結果可以數周甚至數月后觀察，而 AMCA 的信號很快淬滅。FITC 的標本片不能多日后檢測，因為細胞的自發熒光將背景染色。

2.免疫表型后再次固定，可以使用 1% 或 4% 的多聚甲醛。多聚甲醛可以在 4°C 儲存 2 周以上，而 Camoy 固定液必須每次使用前新鮮配制。緩沖液的固定時間對于成功完成實驗非常重要。細胞固定的時間越短，熒光信號損失的越多。然而太長的固定時間將導致 FISH 雜交效率的大幅度降低。

3.免疫表型中，為排除錯誤的陰性結果，必須進行陰性對照實驗。對照實驗中任何熒光信號都應沒有雜信號干擾。將單抗或基礎抗體用水、PBS 或無關的同型抗體作為陰性對照。為排除干擾雜交或不同動物來源多克隆抗體的干擾，對照實驗片應進行雙重免疫表型實驗。

4.在雙重免疫表型實驗中，與含有高濃度鼠免疫球蛋白的 20% 正常鼠血清孵育是成功進行第二次免疫表型的關鍵。兔抗鼠抗體的自由位點被封閉，不能與第二鼠抗人抗體（如 CD8) 結合。這次孵育后不需要洗片。雙重免疫表型細胞進行 FISH 雜交，不使用生物素標記的抗體，因為它們會與第二單克隆鼠抗人抗體非特異性結合。

5.因為彩色熒光的限制，很難在一個實驗中結合三種熒光顏色，如綠 FITC、紅 Cy3、藍 AMCA0 事實上，藍色的 AMCA 熒光非常弱，而且不穩定，只能用在重復序列探針上。另一方面，FITC 比 Cy3 信號強度降低得快，而且與背景的對比度將降低。因此，我們建議使用 Cy3 交聯抗體檢測表達量低的抗原或位置小的特異性 DNA 探針。

6.我們沒有發現分別變性和同時變性的細胞 DNA 和探針的結果有什么不同。許多實驗室采用靶細胞 DNA 和探針 DNA 分別變性，隨后 DNA 探針與人 Cot-1DNA 進行預復性。我們認為同時變性比較快速簡便，結果與分別變性差不多。

7.在 FISH 研究中，我們發現在 0.IXSSC 中 60°C 進行 3 次雜交后洗脫，其洗脫效率與 42°C50% 甲酰胺/2XSSC 的差不多，而前者便宜、無毒。