膽囊惡性腫瘤的分子生物學研究進展

　膽道系統惡性腫瘤包括膽囊癌和膽管癌。以往曾認為膽道癌為罕見疾病，但是近年來膽道腫瘤發病率有明顯上升趨勢。膽道癌出現臨床癥狀多屬晚期，療效差，預后不佳。因而對其發病機制的探討和早期診斷研究正日益引起人們重視。八十年代后期以來，癌基因和抑癌基因的研究成為腫瘤研究的熱門課題，有希望為惡性腫瘤的診斷和治療提供一條全新途徑。膽道腫瘤的基因研究也逐漸得到人們的關注。

　　迄今為止已發現和膽道腫瘤有關的癌基因有 ras（ k－ ras， n－ ras）、 c－ myc、 c－ erbB－2、某些細胞因子及其受體、抗癌基因有 p53、 p16／ mTS1、 aPC、 dCC等。

　　1　癌基因

　　ras基因是一個常見的癌基因家族，由 k－ ras， n－ ras，和 h－ ras三個成員構成^［1］。細胞中正常 ras基因編碼高度相關的分子量為21000的蛋白質（ p21）。 p21是一種鳥嘌呤核苷酸（ gTP）結合蛋白，它由188或189個氨基酸組成，和細胞生長和分化密切相關。正常 p21和 gTP結合后激活磷脂酶 c，產生第二信使三磷酸肌醇（ iP3）和二酰甘油（ dG），之后 gTP被 p21降解，第二信使便執行使細胞分化和生長功能。若正常的 ras基因發生了突變而變成了癌基因，其所編碼的變異 p21蛋白仍能同 gTP結合但是失去了降解 gTP的功能，從而使磷酸脂酶 c持續活化，產生大量 iP3和 dG，引細胞過度增殖，zui終發生癌變^［1］。

　　現在已在人類多種腫瘤中檢測到了 ras基因突變^［1］。40％的結腸癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可檢測到 ras基因的突變。其突變的作者單位：中國醫科大學第二臨床學院肝膽外科（沈陽110003）崔健現在上海醫科大學中山醫院肝癌研究所（200032）主要方式是點突變，12、13、61密碼子是突變熱點。在胰腺癌中 k－ ras基因的突變率高達90％以上，而且突變的位點大多局限于 k－ ras基因12位點上^［2］。但是對于膽系腫瘤，關于 ras基因突變研究文獻極少，而且結果差異很大，甚至還有完全相反的報道^［3～5］。

　　almoguera應用 rNA酶錯配切割法和 dNA直接測序，分析膽道腫瘤的病理標本時，未見任何 ras基因改變^［2］。而 tada等應用 dNA測序法研究膽囊癌和膽管癌標本發現肝外膽管癌中偶有 ras基因突變，在膽囊癌中則不存在 ras基因改變^［3］。與之相反， levi等的研究結果表明膽系腫瘤中存在著廣泛 ras基因點突變^［4］。他們認為以往文獻所報道的膽系惡性腫瘤中 k－ ras基因低突變率的原因不在于腫瘤細胞中真的不存在 k－ ras基因改變，而是檢測方法靈敏度不夠所致。 dNA直接測序時，大約需要20％的細胞發生突變才能得到陽性結果，而 rNA酶寡核苷酸錯配切割法的靈敏度則更低。他們認為，由于膽道腫瘤是多克隆發病，因而發生 k－ ras基因突變的細胞只是一小部分，用常規的實驗方法難以檢測出來。他們應用改良的兩步 pCR－ rFLP法（兩輪堿基錯配 pCR＋兩輪限制性核酸內切酶酶切）配以 dNA直接測序，發現肝外膽管癌中 k－ ras基因突變率為100％。這種方法靈敏度非常高，可以在512個等位基因中檢測到一個基因的點突變。

　　watanabe等應用與 levi類似但更為簡便的方法檢測了20例膽道腫瘤的標本^［5］。結果發現55％的膽囊癌、100％的肝外膽管癌均存在 k－ ras基因改變。總的突變率為75％。絕大多數突變發生在第12位密碼子。常見的突變方式是 g→ a，使 gGT變成了 gAT，所編碼的氨基酸也隨之由甘氨酸變成了天冬氨酸。少部分發生 gGT→ gTT及 gGT→ tTT改變，這些都導致了相應氨基酸改變，因而均是有意義突變。更為重要的是，他們發現一例膽囊腺瘤癌變的標本中，表面正常的腺瘤已經發生了 k－ ras基因突變，而且突變方式和癌組織完全一樣，從而在基因水平上支持了膽囊腺瘤癌變的理論。

　　ajiki等的研究亦表明 k－ ras基因突變是膽道腫瘤中的一種普遍現象^［6］。在他們的研究中，膽囊癌、膽管癌、膽囊上皮不典型增生的 k－ ras基因12位點的點突變率分別為57％、59％、73％。他們的實驗也發現了一個很有意義的現象：9例發生在膽囊癌周圍的不典型增生，都表現出了和膽囊癌相同的突變。因此他們認為在某些致癌因素（如：膽石、長期膽汁酸刺激等）的作用下，膽囊粘膜腸上皮化生→膽囊粘膜不典型增生→膽囊癌是膽囊癌的發病機制之一。

　　yukama等應用免疫組織化學方法研究了慢性膽囊炎、早期膽囊癌和進展期膽囊癌中 ras基因和其他癌基因產物的表達。發現早期膽囊癌中 ras基因產物 p21陽性表達率高達95％。膽囊炎為33％。其他癌基因產物如 c－ myc、 c－ erbB2、表皮生長因子（ eGF）、轉化生長因子受體（ tGF－β）等在膽囊癌都有高表達，平均陽性率在60％左右。而在慢性膽囊炎中它們表達陽性率較低，平均在10％以下^［7］。 lee等的研究結果也表明，與膽囊不典型增生和慢性膽囊炎相比，膽囊癌中 p21呈現強表達，陽性率為62％，膽管癌中 p21陽性率也達到了50％。 p21表達和預后沒有明顯的關系^［8］。以上學者都認為：膽囊癌發病過程中存在著多種基因共同作用，其中， ras基因突變可能是早期發生的事件之一。這與 ras基因突變在結腸癌發病中的作用是類似的^［9］。

　　c－ erbB2癌基因所編碼產物是一種表皮生長因子受體（ eGFR）類似物。對于它的研究結果不盡相同。 kamel等的研究結果表明膽囊癌中 c－ erbB2·35·肝膽胰外科雜志1999年第11卷第1期陽性率大約為10％。膽囊粘膜不典型增生中，其陽性率為0。他們認為 c－ erbB2表達在膽囊癌中是一較晚事件，只有在細胞癌變后才出現^［10］。而 yukama等的研究表明 c－ erbB2在早期膽囊癌中陽性表達率為69％。在進展期膽囊癌中表達率為0。他們認為 c－ erbB2癌基因突變是膽囊癌發生早期事件之一^［7］。出現這一不同結果的原因可能是：1．他們采用的方法、技術和對陽性率的規定不同。2．所選擇的膽囊癌是由完全兩種不同的致癌因素造成的。因此關于 c－ erbB2在膽囊癌發生中到底起何種作用，仍需進一步研究。

　　2　抑癌基因

　　關于抑癌基因，目前研究zui多的是 p53基因。 p53定位于人染色體17P13，全長為16－20Kb，由11個外顯子構成。正常 p53基因編碼野生型 p53蛋白，是一種分子量為53KD的核內磷蛋白。人的 p53蛋白由393個氨基酸組成。 p53基因突變后所編碼的蛋白稱為變異型 p53。

　　在人乳腺癌、腦瘤、結直腸癌、食管癌和肺癌中均已發現 p53基因突變，總突變率為50％左右^{［11～13］}。其中83％為錯義點突變，6％為無義點突變，10％為插入或缺失突變。 p53的突變并非隨機發生，大多數的突變發生于133－299氨基酸。應用 pCR技術研究后發現密碼子132－145、171－179、239－248、272－286為突變熱點。

　　野生型 p53蛋白的主要功能是：抗細胞增殖，抑制細胞生長分裂，使細胞停止于 g1期而不進入 s期。野生型 p53可以阻礙 dNA復制起始復合物的裝配，抑制 dNA復制，并且在轉錄水平進行調節，防止細胞過度生長分裂。此外野生 p53蛋白還可以誘導細胞分化。野生型 p53基因失活的細胞經久處于未成熟狀態，持續增生。突變型 p53則不具備以上的功能。

　　野生型 p53蛋白極不穩定，半衰期很短，而突變型 p53則很穩定，可以在核內積聚，這使得可以用免疫組織化學方法檢測到它的存在^［14］。突變型 p53的檢測可以很好反映 p53基因突變情況^［15］。這一點不同于 ras基因。 wee等用 s－ p法研究了膽囊癌和肝外膽管癌中 p53蛋白表達，陽性率分別為73％和64％^［16］。他們認為在膽道癌發病過程中， p53基因突變是一個普遍發生的事件，是膽道癌發生內在因素之一。 kamel^［10］等的研究結果也表明在膽道癌中普遍存在著 p53基因突變。更為重要的是，在兩例膽囊上皮不典型增生的標本中，他們也發現了 p53蛋白陽性表達。

　　hanada等研究發現，在病理類型為平坦型的膽囊癌中， p53陽性率高于息肉型膽囊癌。而平坦型癌多為浸潤癌^［17］。 roa的研究也表明，在早期膽囊癌中， p53的陽性率為23．5％，在進展期膽囊癌中， p53的陽性率達到48．2％。在高分化膽囊癌中， p53的陽性率為25％，而在低分化的膽囊癌中， p53的陽性率達到50％^［18］。以上研究均提示 p53高表達是腫瘤分化低、處于進展期、預后不佳的標志。

　　p16是近年發現的比 p53更有力地引起正常細胞癌變的腫瘤抑制基因，又稱為多腫瘤抑制基因（ mTS1）。 p16基因定位于人染色體9P21，由三個外顯子構成。總長度為8．5Kb。其編碼產物 p16蛋白是細胞增殖周期的重要調節者和控制者^［19］。它是細胞周期依賴性激酶4（ cDK4）抑制因子。因而又稱 mTS1／ p16／ cDK4。細胞進入分裂周期依賴于周期蛋白依賴性激酶（ cDKs）的活化， cDK4和 d型周期蛋白結合形成復合物能促進細胞從 g1→ s期的轉變，從而促進細胞增生，這可能是惡性腫瘤發生因素之一。 p16蛋白能和 cDK4結合，抑制細胞轉化。近年來有關 p16基因純合性丟失的研究表明，在人類大部分腫瘤中，均有 p16純合性丟失，與雜合性丟失一起，總的突變率為50％。堿基突變和缺失另占25％，故在腫瘤組織中 p16總突變率為75％，比 p53的50％的突變率高得多。

　　1995年， yoshida等人世界上報告了 p16基因在膽道腫瘤中的突變情況^［20］。他們分析了25例膽道腫瘤標本和4個膽系腫瘤細胞株后發現原發膽道腫瘤中 p16／ mTS1的總突變率為64％（其中膽囊癌80％，膽管癌63％），高于 p53突變率。他們認為在膽系腫瘤發生中， p16可能比 p53起更重要的作用。但是 p16在膽系腫瘤中到底作用如何，具體突變方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一個明確結論。

　　aPC基因和 dCC基因是通過對大腸癌研究在人5號染色體上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，編碼產物分子量超過300，000，調控 ras基因表達。后者也位于5q21，在 aPC附近。關于他們在膽道腫瘤的研究較少。雖然已在2個人類膽管癌細胞株中發現有5號染色體改變^［21］，但應用多種基因探針雜交未發現在肝內膽管癌中有5q^［21，22］缺失，故認為 aPC和 dCC與膽管癌關系不大^［22］。

　　3　前景和展望

　　雖然對于膽系腫瘤的分子生物學研究與胃癌、結直腸癌和胰腺癌相比仍不夠深入，眾多的問題還有待于解決，但是目前的研究結果大大豐富了我們對于膽系腫瘤的認識，這對于尋找早期診斷膽系腫瘤的有效手段具有重要的指導價值。

　　膽道腫瘤發病率近年明顯上升。由于早期診斷困難，故預后極差。尋找一條有效的早期診斷手段是當前研究的重要課題。從胰腺癌的研究中我們可以獲得一些啟發。1990年 shibata對36例胰腺癌標本作細胞學檢查的同時作 k－ ras基因突變分析，結果25例細胞學檢查惡性標本中18例測到了 ras基因點突變^［23］。3例細胞學檢查良性標本無一例發生 ras基因突變。8例細胞學檢查為不典型增生標本中，有兩例發生突變。1991年， tada等對 b超引導下胰腺穿刺所獲得的細胞進行基因分析，檢測 k－ ras基因12位點的突變，成功地為2例細胞學檢查無法判定病變良惡性的病例作出了診斷^［24］。隨著研究方法的不斷改進，特別是改良的二步 pCR－ rFLP方法的應用，人們發現膽道腫瘤中也廣泛存在著 k－ ras基因12位點的突變，總突變率在75％～100％之間，接近于胰腺癌突變水平。由于 pCR技術靈敏性和特異性極高，可以從幾個拷貝的 dNA分子中檢測到 k－ ras基因點突變，因而用十二指腸引流或 pTCD檢查獲得膽汁中的脫落細胞，或在 b超引導下用細針穿刺膽道腫瘤獲得標本，然后用 pCR法檢測標本中 k－ ras基因12位點突變，有可能開創一條早期診斷膽道腫瘤的新途徑，而且對于常規影像學和細胞學檢查有重要補充價值。