膽堿酯酶蛋白分子表面的活性中心有兩個能與乙酰膽堿結合的部位，即帶負電荷的陰離子部位和酯解部位。酯解部位含有一個由絲氨酸的羥基構成的酸性作用點和一個由組氨酸咪唑環構成的堿性作用點，兩者通過氫鍵結合，增強了絲氨酸羥基的親核活性，使之易于與乙酰膽堿結合
膽堿酯酶水解乙酰膽堿的過程可分為三個步驟：
①乙酰膽堿分子結構中帶正電荷的季銨陽離子頭，以靜電引力與膽堿酯酶的陰離子部位相結合；同時乙酰膽堿分子中的羰基碳與膽堿酯酶酯解部位的絲氨酸的羥基以共價鍵形式結合，形成乙酰膽堿和膽堿酯酶的復合物。
②乙酰膽堿與膽堿酯酶復合物裂解成膽堿和乙酰化膽堿酯酶。
③乙酰化膽堿酯酶迅速水解，分離出乙酸，酶的活性恢復。