胚胎小鼠紋狀體神經干細胞分離培養鑒定_原代傳代培養

方法：

神經干細胞的培養

①原代細胞的培養：取孕13.5天昆明種二級孕小鼠，引臼脫頸處死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐層剖開腹部皮膚、肌肉、腹膜，取出子宮,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔細剝離胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪開顱骨，取出胎鼠腦組織并轉移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，體視顯微鏡下剝離腦膜,分離胎鼠紋狀體，仔細剝離血管及腦膜，將收集到的紋狀體在D-hanks液中漂洗兩次，置于盛有4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪將組織剪碎,加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期間每隔5min震蕩一次。500轉離心5min, 棄上清，D-hanks液清洗兩次，將沉淀細胞重懸于增殖培養基中，培養基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、鏈霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰拋光的吸管反復吹打，分散組織制成單細胞懸液，吸取9滴細胞懸液、1滴0.4℅臺盼藍溶液混合，用血細胞計數板在3分鐘內計數出活細胞和死細胞（臺盼藍排斥法），調整細胞密度，以105個/ mL接種75mL培養瓶中（NUNC）, 于5℅CO2 培養箱, 37℃培養。期間倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。

②傳代培養：當神經球直徑大約100um時收集細胞于離心管中，600轉離心5分鐘，棄上清，加入無血清培養基重懸細胞，吸管輕輕吹打細胞，使之形成單細胞懸液，計數后以104個/ mL接種75mL培養瓶中，于5℅CO2 培養箱, 37℃培養，完成一次傳代。此后每隔兩天半量換液，5-7天機械分離細胞傳代1次。期間倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。胚胎小鼠紋狀體神經干細胞的分離培養及鑒定。