目的要求
1．學習胰蛋白酶的純化及其結晶的基本方法。
2．了解酶的活性與比活性的概念。
實驗原理
胰蛋白酶是以無活性的酶原形式存在于動物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開，失去一段六肽，分子構象發生一定改變后轉變為有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH=3時最穩定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH>5時易自溶。Ca2+離子對胰蛋白酶有穩定作用。
重金屬離子，有機磷化合物和反應物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發現在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。
胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現為對堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對這些鍵的敏感性次序為：酯鍵>
酰胺鍵>
肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來測定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（簡稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡稱BANA）測定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡稱BAEE）和對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡稱TAME）測定酯酶活力。本實驗以BAEE為底物，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規定常因底物及測定方法而異。
從動物胰臟中提取胰蛋白酶時，一般是用稀酸溶液將胰腺細胞中含有的酶原提取出來，然后再根據等電點沉淀的原理，調節pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉變為有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和彈性蛋白酶同時也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級分，并用結晶法進一步分離純化。一般經過2～3次結晶后，可獲得相當純的胰蛋白酶，其比活力可達到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。
如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過親和層析方法純化。
試劑和器材
1．試劑
（1）pH2.5乙酸酸化水。
（2）2.5mol/L H2SO4。
（3）5 mol/L NaOH。
（4）2 mol/L NaOH。
（5）2mol/L HCl。
（6）0.001M HCl。
（7）硫酸銨。
（8）氯化鈣。