脂染介導的DNA轉染實驗

指數生長的哺乳動物細胞培養物

脂染試劑 NaCl 枸櫞酸鈉 質粒 DNA 純化閉環質粒 DNA 細胞生長培養基

試管 聚苯乙烯或聚丙烯試管 組織培養皿

材料

緩沖液與溶液
貯存溶液、緩沖液與試劑的成分見附錄 1。將貯存液稀釋成適當濃度。

脂染試劑


NaCl(5mol/L)(選用）
用于稀釋 DOGA。

枸櫞酸鈉（pH5.5,20 mmol/L) 含 150 mmol/LNaCl(選用）
DOGS 用作脂染試劑時，可用于代替滅菌水稀釋質粒 DNA（Kichler et al.1998)。

核酸與寡核苷酸

質粒 DNA
如果是第一次用脂染或使用不熟悉的細胞系，應使用編碼大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶或者綠色熒光蛋白的表達質粒（見第 17 章信息欄中的綠色熒光蛋白）。這些質粒可從幾個生產商處購買（如，pCMV-SPORT-β-gal,Life Technologies 公司，pEGFP-F,CLOTECH 公司；見圖 16-2,16-3)。

純化閉環質粒 DNA 可用層析柱或按照第 1 章介紹的溴化乙錠-CsCl 梯度離心。
DNA 用水溶至 1ug/ul。



培養基

細胞生長培養基 [完全培養基，無血清培養基與（備選的）選擇性培養基]

特殊設備

試管，聚苯乙烯或聚丙烯試管
DGTMA 會與聚丙烯發生非特異性結合，必須使用聚苯乙烯試管。

組織培養皿（60 mm)
本方法是按照使用 60 mm 細胞培養皿設計的，如果使用多孔平板、細胞瓶、或者不同直徑的平皿，則應按比例改變細胞密度與試刑用量。見表 16-3。

附加試劑

本方法步驟 9 可能需要第 17 章方案 7 所列試劑。

細胞與組織

指數生長的哺乳動物細胞培養物






方法

1. 脂染前 24 h, 通過胰酶消化收集細胞，以 10⁵ 細胞/平皿的密度平鋪細胞于 60 mm 組織培養皿上（或 5X10⁴ 細胞/35 mm 平皿)。加 5 ml 生長培養基（用 35 mm 平皿則加 3 ml)，于含 5%~7%CO₂ 的 37°C 溫箱孵育 20~24 h。
轉染時細胞應 75% 長滿。如果轉染前細胞生長不足 12 h, 細胞就不能很好地吸附在培養皿上，與脂類接觸時易于脫落。

2. 用 100ul 滅菌去離子水（使用 Lipofectin 時）或含 150 mmol/LNaCl 的 20 mmol/L 枸櫞酸鈉（pH5.5)(使用 Transfectam 時）于聚苯乙烯或聚丙烯試管內稀釋 1~10ug 質粒 DNA。在另一個試管內用滅菌去離子水或 300 mmol/LNaCl 將 2~50ul 脂溶液稀釋至 100ul。
重要事項：用 Lipofectin 轉染時，由于陽離子脂類 DOTMA 會與聚丙烯發生非待異性結合，故使用聚苯乙烯試管，不要用聚丙烯試管。至于其他陽離子脂類，根據生產商的推薦選擇試管。

3. 室溫下孵育 10 min。

4. 將脂溶液加入 DNA 中，用吸管吹打幾次混勻，室溫下孵育 10 min。

5. 孵育 DNA-脂溶液時，用無血清培養基將要轉染的細胞洗滌 3 次，然后于每一 60 mm 平皿中加入 0.5 ml 無血清培養基，將細胞再放入含 5%~7%CO₂ 的 37°C 溫箱中孵育。
在加 DNA-脂溶液前，用無血淸培養基洗滌要轉染的細胞非常重要有時候，血清會強力抑制轉染（Felgner and Holm 1989)，同樣，胞外基質復合物，如硫酸蛋白聚糖也會抑制轉染，可能是通過結合 DNA-脂類而阻止受體細胞質膜與其發生相互作用。

6.DNA-脂溶液孵育 10min 后，于每一管內加入 900ul 無血清培養基。用吸管吹打幾次混勻，室溫下孵育 10 min。

7. 轉移各管 DNA-脂溶液至 60 mm 平皿的細胞中，于含 5%~7%CO₂ 的 37°C 溫箱中孵育 1~24 h。

8. 細胞在 DNA 中孵育適當時間后，用無血清培養基洗滌 3 次，加入完全培養基解育。

9. 如果是穩定轉染細胞，繼續進行步驟 10。脂染 24~96 h 后用下述方法之一檢査細胞。

? 如果使用表達β-葡萄糖醛酸酶的質粒 DNA, 按照第 17 章方案 7 所述步驟檢測細胞裂解液中酶的活性，或者依照附加方案：單層細胞組化染色鑒定β-葡萄糖醛酸酶所述通過組化染色檢測。

? 如果使用表達綠色熒光蛋白的質粒 DNA, 在 450~490nm 光下用顯微鏡檢査細胞。

? 如果使用其他基因產物為標志，可以通過體內代謝標志進行放射免疫、免疫印潰、免疫沉淀，或者分析細胞提取物中酶活性等方法分析新合成的蛋白。
為減小不同培養血之間轉染效率的差異，最好 （1）. 用每一構建體轉染數個培養皿；（2）. 孵育 24 h 后用胰酶消化細胞；（3）. 將細胞匯集起來；以及 （4）. 重鋪細胞于幾個培養皿上。

10. 分離穩定轉染體：細胞在完全培養基中孵育 48~72 h 后，用胰酶消化細胞并用合適的選擇培養基重鋪細胞。每 2~4 天更換培養基，持續培養 2~3 周，目的是清除死細胞殘骸，促進抗性細胞生長。這樣，獨立克隆便可以克隆、繁殖，以用于檢測 (方法見 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《細胞實驗手冊》的第 86 章])。
用預冷的甲醇固定細胞 l5 min. 然后室溫下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水沖洗，這樣可以紀錄細胞克隆數目。Giemsa 染液應是使用前用磷酸鹽緩沖液或水新制備的，用 Whatman1 號濾紙過濾。