基本方案通過蔗糖梯度浮選 法 制備 去 污劑 抗 性的 膜 并 通 過免 疫 印 跡 對蛋 白質進行分析材 料細胞，貼壁或非貼壁 N E /P 緩沖液，單獨或包含以下一種或多種組分： 1 % 、 2 % 或 5 % (W V ) TritonX-IOO 0.lmol/L 碳酸鈉， pHll 5 % 、 3 5 % 或 8 0 % (m /V ) 蔗糖 60m m o l /L 辛基葡糖苷 T N E 緩沖液 去污劑相容的蛋白質檢測試劑盒（如 Bio-Rad) 2 X 或 6 X S D S /樣品緩沖液 丙 酮（可選），冰冷的 乙 醚（可選） I O c m 的 組 織 培 養 皿（用于貼壁細胞） 22 G 針頭 I m l 和 5m l 的注射器 S W 4 1 轉子和超速離心管（B e c k m a n ) 對于貼壁細胞，無需進行比較的細胞系 la. 將細胞鋪于 2 個 I O c m 組織培養皿中，生長至細胞匯合。對 于 D R M 脂 質 分 析（見輔助方案3)，則接種細胞至5 個 培 養 皿 或 1 0 個培養皿以定量磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇或含量稀少的神經節苷脂。 2a. 用 I m l 含 有 1 % 或 2 % Triton X -100 的 T N E / P 緩沖液置冰上裂解細胞20 min。如果有必要，在裂解緩沖液中加入0. lmol/L 碳酸鈉， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂類得率，提 高 D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合。在分析 D R M 中的酶活性時，不能使用碳酸鹽。 3a. 用細胞刮或橡皮刮將培養皿細胞裂解物刮下來，收于管中。 4a. 如果溶解緩沖液含有碳酸鹽，將裂解液通過帶 22 G 針 頭 的 5m l 注 射 器 1 0 次（保持裂解產物低溫）用于剪切 D N A ，以確保D R M 移至正確的梯度。
對于貼壁細胞，細胞間需進行比較的細胞系 lb. 如需比較兩個不同的細胞類型間D R M 的豐度和得率，按照步驟Ia所示用培養皿培養不同細胞類型的細胞，對每種細胞另接種一個培養皿（以測定培養物的蛋白質含量），確保每個培養皿的細胞數相同。 2b. 用 5 ml T N E 緩沖液漂洗每種類型細胞的一個培養皿2 次 ，用 I m l 含 有 1 % TritonX -100或 者 0. lmol/L 碳酸鈉的 T N E /P 緩沖液裂解細胞。將黏稠的細胞裂解物立即轉 移 至 1.5m l 微量離心管內，并 通 過 22 G 針頭連接的 I m i 注 射 器 1 0 次（或直到黏滯性消失）以剪切D N A 。然后以最大速度離心。 3b. 用去污劑相容的蛋白質檢測試劑盒測定5?IOul等份裂解物的蛋白質含量。將 T N E緩沖液與含有2 % 或 5 % Trit〇n X -100的 T N E 緩沖液混合，來制備含有足量TritonX -100的 T N E /P 緩沖液，使 用 去 污 劑 ：蛋 白 質 為 10 : I (m /m ) 混 合 。為增加與脂筏結合較弱蛋白質的得率，使用去污劑：蛋白質為2 : 5 (m /m ) 混合。 4b. 加 入 I m l 含 有 1 % Triton X -IOO 的冰冷T N E /P 緩沖液至剩余的培養皿中，在冰上裂解細胞20 min，在裂解緩沖液中加入0.lmol/L 碳酸鈉， p H l l ，以便更好地定量D R M 脂類得率，提 高 D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合 。在分析 D R M 中的酶活性時，不能使用碳酸鹽。按照步驟3a 所示操作；如果有必要，按照步驟4a 所示操作。 對于非貼壁細胞 Ic. 培養約5X 107個細胞，并 4°C ， 200g離 心 5 min。如需進行細胞間的比較時，應使細胞(來源相同）數量相同。對于脂類分析（見輔助方案3)，使 用 2X 108的非貼壁細胞。 2c. 用 5m l 冰 浴 的 T N E 緩沖液重懸細胞，重 復 洗 2 次 。 3c. 用 2m l 含 有 1 % 的 Triton X -100的 T N E /P 緩沖液在冰上裂解細胞20 min。在裂解緩 沖 液中加入〇.lmol/L 碳 酸 鈉 ， p H l l ，以 便 更 好 地 定 量 D R M 脂 類 得 率 ，提髙D R M 脂質得率，或減少外周或細胞骨架蛋白與D R M 的結合。在 分 析 D R M 中的酶
活性時，不能使用碳酸鹽。 4c. 如果有必要，按照步驟4a 進行操作。 5 . 將裂解產物與含有8 0 % 蔗 糖的冰冷T N E /P 緩沖液混合。對于來自貼壁細胞的裂解物 ，需要上述加至培養皿中的裂解緩沖液總體積為1.25倍 體 積（即對于 步 驟 3a 或4b 收集的裂解物，加 1.25 ml)。對于非貼壁細胞的裂解物，加 2. 5m l 。完全混合并靜置幾分鐘以便減少泡沫。 6 . 轉移至一個或多個S W 4 1 超速離心管內，移去可能存在的泡沫。每管不超過5 ml。用冰冷的含有3 5 % 蔗 糖 的 T N E /P 緩 沖 液 6?7m l 小心地覆蓋到裂解物/蔗糖復合物上(分層應盡可能的寬），開始倒入液體時應注意觀察以確保其可以浮在上層。如果沒有浮起，則從微量離心管中移去混合物，并徹底混合。如果必要的話，加入少量的8 0 % 蔗糖。 7 . 用 含 5 % 蔗 糖 的 冰 冷 T N E /P 緩 沖 液 填 充 離 心 管 至 距 離 頂 端 約 3m m 。配 平 ， 4°C ，l 〇0 00Qg 離心> 3 h (至 24 h)。 蛋白質梯度分布的檢測 8a. 從底端分段收集梯度上的成分，每 份 收 集 lml。加 2 X 或 6 X S D S /樣品緩沖液，通過 SDS-P A G E (單 元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 分析其中 50?100ul 組分。 對于無需免疫沉淀的免疫印跡 8b. 用 5m l 注 射 器 22 G 針頭從離心管的頂端在 5%/35% 蔗糖交界處收集可見的條帶置于 1 個 S W 4 1 超速離心管中。用 冰 冷 的 T N E /P 緩沖液稀釋該膜成分，直到注滿離心管。 4°(：， 100 00(^離心 111。 9b. 移棄上清液。用 100?2 0 0 4 T N E /P 緩沖液移出沉淀物并移至一微量離心管內。用200ul T N E /P 緩沖液清洗超離心管 3 次 ，刮擦管底部以收集沉淀物碎片。將這些清洗液與沉淀物合并。 10b. 4°C ，最高轉速離心 IOmin 以沉淀 D R M 。棄上清液。直接用 2X 或 6X S D S /樣品緩沖液溶解 D R M ，通 過 SDS-PAGE (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 進行分析。 對于低分子質量蛋白質 8c. 依步驟 8b?IOb 制 備 D R M 沉淀物，不 用 S D S /樣品緩沖液來溶解。加 I m l 冰冷的丙酮 至 D R M 沉淀物里，渦旋混勻，置 冰 上 孵 育 lOmin。 4°C ，最 高 轉 速 離 心 lOmin，移棄丙酮。 9c. 在室溫下加 I m l 二乙基醚至管內，渦旋混勻，如上述操作進行沉淀。移去醚并風干。用 2 X 或 6X S D S /樣品緩沖液溶解 D R M 蛋白，以 S D S - P A G E (單 元 12. 3 ) 和免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 進行分析。 免疫沉淀后的免疫印跡 8d. 依照步驟 8b?IOb 制 備 D R M 沉淀物，不 用 S D S /樣品緩沖液來溶解。用 I m l 含有1 % Triton X -IOO 的 T N E /P 緩 沖 液 溶 解 D R M ，置 37°C 孵 育 5 min，或 者 加 入 Iml含 有 60m m o l /L 辛（烷）基葡糖苷的 T N E /P 緩沖液，置冰上孵育 20 min。 9d. 4°C ，最高轉速離心 5 min，以沉淀任何殘存的不溶性物質。將澄清的可溶性 D R M移至新管，通 過 免 疫 共 沉 淀 試 驗（單 元 12. 2 ) 回收目的蛋白，以 S D S - P A G E (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡 法（單 元 12. 5 ) 進行分析。 備 選 方 案 用 離 心 法 制 備 去 污 劑 抗 性 的 膜附 加 材 料
在 S D S 中的溶解
3a 用 100ul 沉淀物裂解液重懸 Triton X -IOO的裂解沉淀。使混合物通過帶22 G 針頭的I m l 注 射 器（以剪切D N A ) 至均一。用 I m l 包 含 1 % Triton X -100的 冰 冷 T N E / P緩沖液進行稀釋， 4°C ，最大速度離心 2 min，保留上清，棄去剩余的不溶性物質。 4a. 為 了 進 行 2 個組分的比較，用 2 0 % 的 S D S 儲 存 液 將 初 始 的 Triton X -100 上清液(步驟 2 ) 調整至終濃度 0.1% S D S 。用 免 疫 共 沉 淀（單 元 12. 2)、 S D S - P A G E (單
元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 對等量的 2 個組分進行分析。 在 辛 基 葡 糖 苷 中 的 溶 解 3b. 用 I m l 含 有 60 mmo l /L 辛 基 葡 糖苷的冰冷的 T N E /P 緩 沖 液 于 冰 上 重 懸 Triton X -100 裂解沉淀 20 min，以便溶解 D R M 蛋白。渦旋混勻， 4°C ，最高速 度 離 心 2 min，保留上清液并棄去沉淀。 4b 通過免疫沉淀（單 元 12. 2)、 S D S - P A G E (單元 12. 3 ) 和 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 等方法，對等量的該組分及原始的 Triton X -100 裂 解 上 清（步 驟 2 ) 進行分析。 輔 助 方 案 1 脈沖追蹤方法分析去污劑抗性的膜蛋白附 加 材 料
輔 助 方 案 2 通過放射性標記檢測去污劑抗性的膜蛋白的全部組分附 加 材 料P B S ，無菌 無甲硫氨酸、包含透析血清的培養基（透析血清方法見附錄 1 ; 用量取決于細胞類型） [35S] 甲硫氨酸 1 . 在 I O c m 組織培養皿里接種貼壁細胞。如果有必要，將待測細胞接種于兩個培養皿里 ，但是只對其中一個培養皿進行標記（對于非貼壁細胞，接 種 5 X 1 0 6 個細胞，離
輔 助 方 案 3 定 量 高 效 薄 層 色 譜 法（HP-TLC) 進 行 DRM 脂質分析材 料甲醇 氯仿 I : 1 和 2 : I (V /V ) 氯仿/ 甲醇 溶 劑 A : 30 : 60 : 8 (V /V A O 氯仿/甲醇/水 硅 焼 化 試 劑（Sigmacote， Sigma) D E A E 葡 聚 糖 凝 膠（Sephadex) 混 懸 物（見輔助方案 4) 溶 劑 B : 30 : 60 : 8 (V 7V7 V ) 氯仿/甲醇/0? 8mol/L 乙酸鈉 8 : 4 : 3 氯仿/甲醇/0. lmol/L 氯化鈉 0.lmol/L 氯化鈉 溶 劑 C : 3 : 48 : 47 (W V /V ) 氯仿/ 甲醇/0.lmol/L 氯化鈉 溶 劑 D : 3 : 48 : 47 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/水 氮氣 反 相 C 1 8 柱（見輔助方案 5) 中性脂質標準品 酸性脂質標準品 乙酸 甲酸 己烷 異丙醚 脂類顯影試劑 S W 2 8 轉 子 和 超 速 離 心 管（Beckman) 帶 Teflon 內襯蓋子的 15m l 玻璃管 大 功 率（Laboratory Supplies，型 號 G S P 1T ) 或標準浴槽超聲破碎儀 24m m Whatman G F /C 玻璃纖維濾器 過濾設備：玻璃微量分析過濾裝置（Fisher) ，或以 橡 膠 墊 圈 插 入 125m l 側臂燒瓶的 24m m Buchner 漏斗 帶磨口玻璃瓶頸的 125m l 平底燒瓶和管子 旋轉蒸發器 玻璃棉 一 次 性 IO m l 寬口玻璃移液管 玻璃棒 IO m l 硅烷化移液管 5m l 帶 T e f lo n 內襯蓋子的錐形玻璃管 帶單孔瓶塞的 125m l 側臂燒瓶 無熒光指示劑的 1 0 c m X 2 0 c m 髙 效 薄 層 色 譜（H P -T L C ) 板（Merck) 帶玻璃蓋的薄層色譜缸 預 熱 至 l〇〇°C 、 110°C 、 180°C 的烤箱 改 良 的 IOjL d H a m ilton 注射器：帶有斜切邊緣的注射器，可將上樣角度減少一半，有利于少量滴劑的上樣 帶磨口玻璃塞的 IOOm l 刻度量筒 剪成色譜缸大小的吸水紙 有冷卻裝置的吹風機 0.5 ?I c m 厚錯塊 光密度計 注 ：所有接觸 D E A E 葡聚糖凝膠的玻璃制品使用前均要硅烷化處理。玻璃棉裝好后 ，把玻璃棉和柱子一同進行硅烷化處理。 1 . 準 備 1 0 瓶 I O c m 培養皿貼壁細胞的裂解產物（見基本方案，步 驟 Ia?4a) 或 者 2 XIO8 個的非貼壁細胞的裂解產物（見基本方案，步 驟 Ic?4c)。 2 . 利用蔗糖梯度浮選法制備 D R M (見基本方案，步 驟 5?7)。從交界面處獲取并離心收 集 D R M (見基本方案，步 驟 8b?IOb) ，使 用 S W 2 8 而不用 S W 4 1 轉子并且按比例增加體積。 3.D R M 沉 淀 中 加 入 I m l 甲醇，劇 烈 振 蕩 至 沉 淀 懸 起 ，移 入 帶 有 T e f l o n 內襯蓋子的1 5 m l 玻璃管中。用 I m l 甲 醇 洗 2 次 ，將每一次的洗液合并入原管。再 加 入 3m l 氯
仿 ，隨后加入 6 ml 1 : 1 (W V ) 甲醇和氯仿混合物。 4 . 應用高強度浴槽型超聲破碎儀（推薦使用）或者標準超聲破碎儀處理幾秒。室溫振蕩孵育過夜。在真空中用 24m m Whatman G F /C 玻璃纖維濾器過濾到 125m l 側臂燒瓶中。 5 . 用 IOml I : I (V7 V ) 甲醇和氯仿溶液沖洗過濾器。將溶液倒入一個適用于旋轉蒸發器的帶磨口玻璃瓶頸的 125m l 平底燒瓶中，用旋轉蒸發器干燥。置 5m l 溶劑 A 中溶解脂質。 6 . 用玻璃棒將一小卷玻璃棉塞到一個 IO m l 寬口玻璃移液管的尖端。把柱子裝在環狀支架連接或者用夾子夾住。將 2 m l 硅烷化試劑注入移液管和玻璃棉。 5m l 甲醇沖洗并且確保玻璃棉沒有沾在移液管內側壁上。 7 . 用一只 IOm l 硅烷化移液管，向柱內加入足夠量的 D E A E 葡聚糖凝膠以形成一個 2m l 柱床。用 10 倍柱體積的溶劑 A 填塞柱子。用巴氏移液管將溶解的脂質上柱。用 10 倍柱體
16.用 I : I (V /V ) 氯仿/甲醇溶解脂質。調整每個樣品的濃度，預計上樣量為 5?20ul(每種脂質含量在 1?7/xg) 。 試驗幾種濃度以確保有一種濃度在標準曲線范圍內。 17.用改良的 10M1 Hamilton 注射器上第一個樣品，在起始線的兩個點之間點入一系列擴 散 至 5m m 寬的極小液滴。使溶劑短暫干燥后接著在前一樣品上點入更小的液滴，持續點樣直至所需的上樣量。 1 8 . 將剩余樣品上樣，并選取合適的中性或酸性脂類對照，上 樣 5 ul (含 1 ? 7ug脂質），將平板室溫干燥 5m in 。 臨用前在帶磨口玻璃塞的 IOOm l 量 筒 中 配 制 70. 8m l 溶 劑 I :4 2 m l 氯仿、 1 8m l 甲醇、 7 . 2 m l 乙酸、 2 . 4 m l 甲酸和 1 . 2m l 蒸鎦水。 19.在 T L C 缸中加入溶劑和吸水紙，使吸水紙飽和，立 即 以 玻 片 蓋 住 并 以 重 物（如兩個裝滿液體的 4L 水罐）壓住防止揮發。將 點 有 樣 品 的 T L C 平 板 放 于 T L C 缸 中 ，使起始位置處在缸底部，立即蓋上并壓上重物。 20.溶劑前沿泳動至距離平板底部 6 cm (到達事先用鉛筆標記的位置）時 ，從缸中取出平板，風 干 15?30 min。如果有必要也可用電吹風的冷風吹干。溶劑揮發期間可同時在帶磨口玻璃塞的IOOml 量筒中配制 102m l 的溶劑體系 II: 65m l 己燒、 35m l 異丙 醚 和 2m l 乙酸。 21.在另一個 T L C 缸中加入溶劑和吸水紙，使吸水紙飽和，立即蓋住防止揮發。當第一溶劑揮發后，將點有樣品的T L C 平板放于 T L C 缸中。泳動至溶劑前沿到達平板頂 部（10c m )。從缸中取出平板，風 干 15?30 min。將用過的溶劑丟棄，吸水紙徹底風干留作再次使用（可重復使用若干次）。 22.將平板浸于脂類顯影試劑中，或者在通風櫥中將該液體噴于板上，使其濕透。將其豎起流干液體至板的光澤淡去。 23.將平板置于預熱 100°C 的烤箱中烘干 1 ?2m in ， 待其顏色改變之前取出，然后放置于另一 1 8 0 °C 烘箱中的 0. 5?I . O cm 厚鋁塊上干燥 5?lO m in ， 至顏色充分顯現但尚未出現背景顏色時取出，冷卻待用，如 需 要 保 存（可 達 24 h) ，則 應 以 舊 的 T L C 平
板（其上硅膠均已去除）覆蓋，用塑料膜包裹住，保存于一 20°C 。 2 4 . 在 24 h 內以密度儀掃描色帶，利用中性或酸性脂質標準品繪制標準曲線，將樣品與適當的標準曲線進行比對測定。 展開 | 
